摘要
目的： 1.建立可同时检测尿中三聚氰胺（melamine,MEL）及其同系物的方法，并评价其灵敏性和可靠性; 2.评估单点尿样监测用于人体接触MEL及其同系物后内暴露评估的可行性; 3.探索人体接触MEL及其同系物的主要暴露来源; 4.评估日常生活或特定场景下接触MEL及其同系物后的内外暴露水平与健康受损风险; 5.探究成人接触MEL及其同系物后的内暴露水平与罹患肾结石间的相关性; 6.探究成人接触MEL及其同系物后的内暴露水平与早期肾损伤间的相关性。 方法： 1.招募复旦大学上海医学院43名大学生，收集受试对象的第一天晨尿及后续连续24小时的尿样，直至完成第二天晨尿的采集，标记确切的尿样收集时间，问卷调查受试对象的进餐时间。建立超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时测定所有尿样中MEL及其同系物三聚氰酸二酰胺（AMN）、三聚氰酸一酰胺（AMD），及三聚氰酸（CYA）的浓度。采用Spearman相关性分析探索第二天晨尿和随机单点尿样中MEL及其同系物的浓度与其24小时尿样的平均浓度间的关联。同时，依据尿样的采集时间和学生的进餐时间，绘制受试对象进餐前后尿中MEL及其同系物的浓度随时间的变化趋势图。依据餐后尿中MEL的最大浓度值，估计个体的每日累积摄入量（CDI）及内暴露风险。 2.从上海市零售店或网络渠道随机购买50件不同材质的餐具器皿，包括密胺、竹纤维、小麦秸秆、陶瓷及玻璃材质。采用欧盟参考实验室国家实验室（EURL-NRL）针对食品接触材料规定的迁移条件进行迁移实验，测定模拟物中MEL及其同系物的含量。采用非参数检验对比不同材质的餐具器皿迁移MEL及其同系物的浓度差异。基于不同材质的餐具迁移MEL及其同系物的浓度均值或中位数，估算成人和1岁龄婴幼儿的每日估计摄入量（EDI）,并计算相应的危害商（HQ）值。 3.采集国内8种类别共121个水样，包括瓶装水、自来水、泳池水、河湖水、雨水、井水、过滤水和管网水，测定水样中MEL及其同系物的含量。采用非参数检验对比不同类型水样中MEL及其同系物的浓度差异，并基于全国不同地区自来水样中MEL及其同系物的浓度绘制分布地图。利用外暴露评估方法评估一般人群或水生生物因接触各类水样中MEL及其同系物而可能存在的健康风险。 4.随机选取上海社区自然人群队列中新桥社区115名罹患肾结石的研究对象作为病例组，及同一社区157名未患肾结石者作为对照组。对所有研究对象进行问卷调查及体格检查，收集研究对象的晨尿并检测尿中MEL及其同系物的浓度。采用非参数检验对比病例组和对照组尿中MEL及其同系物的浓度差异。采用2种统计模型探究尿中MEL及其同系物的浓度与罹患肾结石的关系，包括多因素logistic回归模型和贝叶斯核机器回归（BKMR）模型，利用BKMR模型进一步探究各化合物间可能存在的协同作用。 结果： 1.建立同时测定尿中MEL及其同系物的高灵敏性和可靠性方法:联合使用混合型阴离子交换（MAX）和混合型阳离子交换（MCX）固相萃取柱可提取尿中MEL及其同系物。利用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱，通过流动相梯度洗脱联合正负离子同时扫描，可实现MEL及其同系物的色谱峰完全分离且峰型较好，灵敏性和准确性均较高。方法学参数显示4种物质的检出限（limit of detection,LOD）范围为 0.03～0.05 ng/mL，定量限（LOQ）范围为0.11～0.15 ng/mL。MEL及其同系物在不同浓度下加标回收率的范围为94.6％～106.5％,日内精密度的范围为0.73％～8.34％，日间精密度均小于6.80％。建立四种物质标准曲线的线性范围为0.5～1000 ng/mL,R2均超过0.999。 2.单点尿样（如晨尿或随机尿样）监测用于人体接触MEL及其同系物后内暴露评估的可行性:①第二天晨尿中MEL、AMN、AMD,和CYA的浓度与其24小时尿样的平均浓度呈显著正相关（P＜0.05）;②随机单点尿样中MEL、AMN、AMD,和CYA的浓度与其24小时尿样的平均浓度呈显著正相关（P＜0.05）;③在女性中发现第二天晨尿或随机单点尿样中所有MEL及其同系物的浓度与其24小时尿样的平均浓度呈显著正相关，而在男性中仅发现第二天晨尿或随机单点尿样中个别MEL及其同系物的浓度与其24小时尿样的平均浓度呈显著正相关。 3.一般人群可通过接触密胺餐具、水源及进食行为等途径普遍暴露于MEL及其同系物:①除玻璃或陶瓷餐具外，密胺、竹纤维、小麦秸秆餐具器皿均可迁移不同水平的MEL及其同系物。各类餐具迁移MEL及其同系物的总浓度（∑MEL）排序为:竹纤维餐具＞密胺餐具＞小麦秸秆餐具＞玻璃或陶瓷餐具（P＜0.001）。密胺和竹纤维餐具以迁移MEL为主，而小麦秸秆餐具以迁移CYA为主。密胺、竹纤维及小麦秸秆餐具经内表面积校正后MEL的浓度超过国家标准的比率分别为2.33％、35.90％和0.00％;②不种类别水样中EMEL的平均值排序分别为:泳池水（14479.51 ng/mL）＞井水（183.03 ng/mL）＞雨水（79.65ng/mL）＞过滤水（78.11 ng/mL）＞瓶装水（30.94ng/mL）＞河湖水（5.74ng/mL）＞自来水（3.60ng/mL）＞管网水（3.33 ng/mL）。井水和雨水中MEL的中位数浓度最高，而泳池水中含有极高浓度的CYA。MEL是井水和雨水中发现的主要化学物，而CYA是泳池水、过滤水、瓶装水、自来水、河湖水和管网水中发现的主要化学物。全国31个地区自来水样中MEL及其同系物的浓度呈现东部沿海地区以及中部地区的浓度较高，而西部以及北部地区的浓度较低;③尿中MEL的浓度与食物摄入的时间相关性显示餐后尿中MEL的浓度迅速增加，在约3小时达到最大值8.6 ng/mL,之后逐渐下降至接近基线水平（P=0.006）。餐后尿中MEL的平均浓度（6.70ng/mL）是餐前浓度（0.39ng/mL）的约17.18倍。按性别及三餐的分层分析结果显示尿中MEL的浓度随时间的变化趋势与总体趋势相似。 4.通过饮水、摄入含MEL及其同系物的食物或密胺餐具迁移至食物可增加人群暴露MEL及其同系物的风险:①基于密胺、竹纤维，和小麦秸秆餐具析出MEL、AMN,和AMD的总浓度计算HQ值，在成人中HQ值＞1的比例分别为53.50％、92.30％、0.00％;而在1岁龄婴幼儿中HQ 值＞1的比例分别为86.00％、100.00％、0.00％。基于密胺、竹纤维，和小麦秸秆餐具析出CYA的浓度计算HQ值，在成人中HQ 值＞1的比例分别为2.30％、0.00％、1.90％;而在1岁龄婴幼儿中HQ值≥1的比例分别为4.70％、0.00％、7.40％;②基于水样中MEL和CYA的平均数或中位数浓度估计人群或水生生物的外暴露风险。 结论： 1.本论文采用UPLC-MS/MS建立同时测量尿中MEL及其同系物的方法，该方法相较于高效液相色谱、气相色谱等，其灵敏性和可靠性均较高。晨尿或随机单点尿中MEL及其同系物的浓度与其24小时尿样的平均浓度呈正相关，表明晨尿或随机单点尿样中MEL及其同系物的浓度监测用于评估个体暴露水平的可行性，为后续的研究提供参考。 2.本论文发现密胺、竹纤维，及小麦秸秆餐具可不同程度地迁移MEL及其同系物，表明此类餐具的使用可增加人群MEL及其同系物的暴露水平。首次发现国内多种类型水样中均含有一定水平的MEL及其同系物，表明国内水环境存在一定程度的MEL及其同系物的污染。依据进餐前后尿中MEL的浓度随时间的变化趋势，表明食物摄入可增加人群MEL的暴露水平。上述结果提示我国人群可能通过接触水源，摄入食物或MEL-甲醛树脂餐具迁移至食物等途径普遍暴露于MEL及其同系物。 3.本论文评估成人或1岁龄婴幼儿使用不同材质餐具进食的外暴露风险，结果提示成人或1岁龄婴幼儿若使用竹纤维或密胺餐具进食可增加MEL和CYA的暴露风险，且1岁龄婴幼儿的暴露风险高于成人。首次在国内报告一般人群或水生生物因接触水源而导致的外暴露风险，结果提示一般人群若以井水作为日常饮用水源或游泳过程中偶然吞咽泳池水均可能增加MEL或CYA的暴露风险。尿中MEL的浓度与食物摄入的时间关联表明餐后可能出现MEL的急性高暴露，从而增加潜在的健康风险。 4.本论文首次采用病例对照研究和横断面研究在成人中发现MEL及其同系物的低剂量暴露与罹患肾结石和早期肾损伤的关系。测定病例组和对照组晨尿中MEL及其同系物的浓度，结果表明成人低剂量的暴露MEL及其同系物与罹患肾结石的风险增加有关，并通过BKMR模型发现各化合物间可能存在协同作用。横断面研究发现美国成人尿中CYA的浓度与血清CYST异常的风险增加有关，提示CYST可能作为CYA暴露引起早期肾损伤的敏感生物标志物。 5.本论文首次采用重复测量研究在成人中验证MEL及其同系物的低剂量暴露与罹患肾结石和早期肾损伤的关系。对663名成人进行2次重复调查，通过腹部B超筛查肾结石的状况，测定晨尿中MEL及其同系物的浓度，并检测空腹血样和晨尿中早期肾损伤标志物的水平。结果证明MEL及其同系物的低剂量暴露在成人肾结石的形成及早期肾损伤中发挥重要作用。同时，首次在人群中发现KIM-1、CYST等新型肾损伤标志物可能作为MEL及其同系物暴露引起早期肾损伤的敏感生物标志物。
NETL