摘要
Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）在抗病毒免疫中发挥关键作用，但IFN-Ⅰ的持续表达是系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫病的致病因素。系统解析IFN-Ⅰ效应的分子机制对于开发干扰素类药物或者阻断IFN-Ⅰ治疗自身免疫的药物具有重要的意义。IFN-Ⅰ的受体（IFNAR）是由IFNAR1和IFNAR2两个亚基组成的异源二聚体。IFN-Ⅰ通过诱导一系列干扰素刺激基因（ISG）发挥其生理、病理或药理功能。绝大多数IFN-Ⅰ研究侧重于解析病毒感染或干扰素药物治疗等高水平IFN-Ⅰ的效应机制。近年来研究发现，生理状态下本底水平IFN-Ⅰ对维持免疫系统的响应能力非常重要，同时也参与调节非免疫器官的发育和功能。另外，SLE等干扰素表达异常的患者体内的IFN-Ⅰ也较低。本论文重点研究低水平IFN-Ⅰ信号诱导ISG的特征及机制。 为了比较IFNAR1和IFNAR2对下游信号通路活化的贡献，我们利用CRISPR/Cas9方法构建了两个受体分别敲除的细胞系。人THP1细胞系中的IFN-Ⅰ信号依赖于IFNAR1与IFNAR2。有意思的是，我们意外地发现三株IFNAR2突变细胞仍然响应IFN-Ⅰ的刺激，它们分别是7碱基纯合缺失（△7）、2碱基纯合缺失（△2）、2碱基缺失和1碱基插入的杂合突变体（△2/+1）。虽然用流式染色的方法检测不到三株细胞表面IFNAR2表达，但它们的活化可以被IFNAR2的抗体所阻断，表明极低水平的IFNAR2表达介导了 IFN-Ⅰ的刺激作用。进一步研究发现7碱基缺失导致第3外显子（42碱基）跳读并形成有功能的IFNAR2突变体;2碱基缺失和1碱基插入导致翻译在+17位AUG重新启动并形成功能性IFNAR2突变体。△2/+1、△2与△7在IFN-Ⅰ刺激下表达的ISG数目递减。其中，△7仅上调21个ISG，我们将它们命名为s-ISG。同时，我们也发现一群以CXCL10为代表的ISG，只能在野生型细胞中有效诱导，而在突变体细胞中的表达水平较难被IFN-Ⅰ上调。 比较IFNAR敲除细胞和对照细胞的转录组，我们发现有27个ISG在野生型细胞表达且在敲除IFNAR1或IFNAR2后显著下调，我们将它们定义为本底ISG。本底ISG与s-ISG高度重叠，表明低浓度IFN-Ⅰ或低水平IFNAR的生物学效应相似。有 7 个 ISG（EPSTI1、IFIT1、IFIT3、MX1、OAS1、OAS2 和 OAS3）同时出现在s-ISG、本底ISG和SLE患者中特征性上调的标志性ISG中，这与SLE患者体内持续低水平IFN-Ⅰ表达的临床特点相一致。 进一步研究结果表明IFNAR的抗体可以抑制本底ISG,表明本底IFN-Ⅰ分泌到胞外并与细胞表面受体结合而发挥作用。IFNB1基因缺失或IFNβ抗体阻断导致本底ISG表达降低，而阻断IFNβ之外所有IFN-Ⅰ对本底ISG表达没有影响，表明IFNβ是本底IFN-Ⅰ信号的主要贡献者。混合培养实验表明，细胞分泌的本底IFN-Ⅰ可以刺激共培养的IFNB1基因缺失细胞表达本底ISG,表明本底IFN-Ⅰ不仅仅作用于产生细胞自身，也能诱导附近细胞表达ISG。进一步研究表明，IFN-Ⅰ的传播范围与分泌细胞的受体丰度呈负相关。 研究不同ISG对IFN-Ⅰ响应的特性，我们发现小剂量IFN-Ⅰ刺激细胞产生本底ISG的水平显著高于非本底ISG（CXCL10）。IFI44L（本底ISG）的启动子序列相比于CXCL10（非本底ISG）启动子对小剂量IFN-Ⅰ刺激的响应能力更强，互换ISRE序列可以转换IFI44L和CXCL10启动子对IFN-Ⅰ的响应能力，表明本底和非本底ISG启动子内ISRE基序的差异决定了它们对低量IFN-Ⅰ的响应能力。另外，过表达ISGF3能够提高野生型细胞中本底ISG的表达水平，表明了 ISGF3与ISRE的结合对低量IFN-Ⅰ效应的影响。 ISG的诱导倍数能够区分不同IFN-Ⅰ响应能力的细胞，本底ISG能够最大程度区分低水平IFN-Ⅰ信号，最终我们通过相关性分析和可行性确定了 4个ISG(MX1、OAS1、OAS2、OAS3）可用于区分低水平IFN-Ⅰ信号强弱，并给出了评分公式。 总之，我们的研究揭示了低水平IFN-Ⅰ信号效应的特点，发现一组ISG对低水平IFN-Ⅰ响应更灵敏。这为揭示SLE等疾病或本底水平下IFN-Ⅰ的效应机制奠定了基础。同时，对ISG诱导条件的系统分析将有利于鉴定恰当的ISG或ISG组合，用于SLE等疾病的诊断或药物的疗效评价。
NETL