摘要
由于抗生素的乱用和滥用而引发的细菌耐药性问题已成为一个世界性的环境问题，对生态环境和人类健康造成严重威胁。调查发现，制药废水处理厂作为阻止污染物向环境扩散的重要屏障，在其废水处理的各个环节中依然存在大量的抗生素抗性细菌（ARBs）和抗生素抗性基因（ARGs）。为了进一步分析制药废水处理厂中的耐药性，本课题采用传统分离培养法，从制药废水处理厂的污泥中分离培养出两株ARBs，分别探究了两株菌对于不同抗生素与重金属离子的抗性，并通过对菌株基因组数据的注释分析进而探究菌株的实际应用潜力。主要研究结果如下： （1）以制药废水处理中脱水污泥为供试材料，利用诺氟沙星抗生素作为唯一碳源从制药废水处理厂的脱水污泥中筛选出4株ARBs。随后通过初步的耐药能力测验进一步筛选出2株ARBs进行后续实验，分别命名为N2和N4。经16S rRNA 基因序列同源性鉴定，并通过系统发育进化树分析确定 N2 菌为Stenotrophomonas acidaminiphila；N4菌为Acinetobacter lwoffii。 （2）选择测定4种抗生素（氯霉素、氨苄西林钠、盐酸四环素和头孢唑林）以及3种重金属离子（Cd2+、Cu2+和Zn2+）对于两株菌的最小抑菌浓度（MIC），进而分析菌株的综合耐药能力。结果显示，氯霉素和头孢唑林对于两株菌的MIC均为1024 mg·L-1，Cu2+和Zn2+对于两株菌的MIC均为512 mg·L-1，反映了两株菌对不同类药物均具有极高的耐药性。随后实验又考察了盐酸四环素和氨苄西林钠分别与Cu2+或Cd2+联合用药时对菌株的抑制情况。结果显示只有氨苄西林钠与Cd2+联用对N2菌表现为协同作用，联用后两药物抑菌效果进一步增强，而其他药物组合对N2菌表现为相加或者无关作用；不同的抗生素和重金属联用时对于N4菌都表现为无关作用或者拮抗作用，并且重金属的加入提高了N4菌对于抗生素的抗性；相同的抗生素-重金属组合对于2株菌展现出完全不同的抑制效果，表现出2株菌的个体差异性。 （3）为了进一步探究所得ARBs的抗性机理及应用潜能，实验选用N4菌株，对其进行了全基因组测序。N4菌基因组大小为3,732,121 bp，编码基因数为3,359个，含有30个质粒。通过抗生素抗性基因（ARGs）分析，在CARD 数据库和ARDB数据库中注释到多个针对不同种类抗生素的多种ARGs，这就解释了菌株在药敏实验中展现出对于多种药物的极高抗性，同时针对氯霉素和β-内酰胺类抗生素的酶修饰基因证明了N4菌对于这两类抗生素具有一定的生物降解潜力。此外，对其功能基因数据库注释分析，发现N4菌的基因组中含有大量无机离子 运输和代谢的基因、负责防御机制的基因、进行代谢与酶促反应的基因以及外源物的生物降解和代谢等方面的功能基因，这些基因的存在进一步证实了N4菌在抗生素或其他相关污染物修复中的应用潜力。
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