摘要
古菌是与细菌和真核生物相并列的第三种生命形式，被认为是真核生物的进化起源;具有独特的环境适应性和生物代谢性能，界定了生物圈的极限，在地球元素和生化循环中均功能重要;具有细菌类似的细胞形态和基因组结构，但却具真核同源的遗传机器等。因此，在遗传机制、生命进化生理代谢性能及生物技术开发应用方面均具有较重要的科学研究价值。但古菌因可纯培养的物种少，且能遗传操作的更少导致对古菌的深入认知和开发应用均非常滞后。产甲烷古菌是自然界中分布最广泛代谢类型最丰富的古菌类群，与人类生活息息相关，其中海沼甲烷球菌（Methanococcus maripaludis）是少数可进行遗传操作的古菌类群之一，其独特的高效固定CO2和H2产甲烷的化能自养生长能力赋予它作为碳源高效转化古菌底盘的生物技术开发潜力。但其传统遗传操作还存在许多缺陷，阻碍了对海沼甲烷球菌在古菌基本生物学研究及生物技术开发应用的研究，亟需一种高效、快速和强大的基因编辑工具。CRISPR-Cas系统是古菌和细菌的适应性免疫系统，经过不断发展，CRISPR-Cas9已被开发成强大的基因编辑工具，用于转录干扰、表观遗传调节和基因组成像等领域。将Cas9核酸酶结构域突变后生成丧失核酸内切酶活性但保留DNA结合功能的dCas9（dead Cas9），已发展为一种新的基因调控手段。本研究在M.maripaludis中开发了 CRISPR-Cas基因组编辑系统，并成功对其基因组进行了高效基因编辑，本论文两部分主要结果如下: 1.在M.maripaludis中开发了 CRISPR单质粒编辑系统pMEV4-Cas9，利用该系统成功敲除了M.maripaludis的单个基因MMP1197,敲除率达100％。其次对基因组上距离较远的两个基因MMP0431和MMP1381进行了同步敲除（75％），同时MMP0431与MMP1381的Western blot无目标蛋白条带，表明双基因同时敲除成功。进一步，我们通过CRISPR-Cas9系统，对M.maripaludis基因大片段，～9 kb的fla操纵子进行完全缺失，敲除率达100％。进而，通过提高Cas9蛋白的表达水平（提高约3倍），成功将M.maripaludis基因组三个基因区域MMP0431、MMP1381和fla,共13个基因实现了同步高效敲除（100％）。该CRISPR-Cas9基因编辑工具较传统方法相比具有效率高、时效快、同步可多基因操作等优势，且因pMEV4-Cas9可通过反向筛选标记快速移除，便于多轮的连续编辑，为复杂的多基因操作研究及合成生物学路径改造等鉴定了重要基础。 2.利用CRISPR-dCas9系统，我们实现了对 M maripaludis非必需基因MMP1718和MMP0372的成功敲低，RT-qPCR结果显示其转录水平最高分别能降低96.2％和98.8％。通过针对MMP1718、MMP0372和报告基因mCherry筛选最佳的sgRNA进行敲低，寻找20-nt sgRNA靶向位置，我们发现sgRNA分别靶向TSS位点附近、ORF框5''端时均可实现较高的敲低效率。基于此，我们进一步设计了分别靶向必需基因MMP0694、MMP1555和MMP0044的sgRNA尝试了对必需基因的敲低。目前可实现敲低必需基因MMP0694、MMP1555和MMP0044在转录水平分别下调了 53％、25％和30％;推测未得到敲低效率较高的突变株可能与基因功能必需性相关。因此，将尝试通过诱导系统可控CRISPR-dCas9表达进行必需基因的敲低。 因此，本研究成功在 M.maripaludis中开发了高效的CRISPR-Cas9及CRISPR-dCas9基因组编辑工具，这不仅解决了传统遗传操作耗时长、因抗性筛选标记少无法多基因同时操作等难点问题，也为利用M.maripaludis这一古菌代表性物种进行古菌基本生物学过程和机制研究及开发M.maripaludis在转化CO2和H2至高附加值化合物如萜类、辅酶、辅基等生物技术开发奠定了重要的工具基础。
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