摘要
柠檬苦素(Limonin)是柑橘类水果主要活性成分之一，主要存在于柑橘籽中，因其具有抗肿瘤、抗炎、防虫杀虫等功效，被广泛应用于制药、食品和农业等领域。从柑橘籽中提取分离柠檬苦素是柑橘资源开发与利用的重要环节，而寻找绿色、环保、高效、低廉的提取方法也是产业化前期研究必须解决的关键问题之一。柠檬苦素的低水溶性会阻碍其在食品和药品中的应用，而纳米封装延缓柠檬苦素的释放可能是解决其利用问题的有效方法。此外，在相关领域中一直缺少能溯源的柠檬苦素纯度标准物质和基体标准物质，导致同样的测量内容在不同国家、不同实验室和不同工作人员间进行时无法比较，难以区分测量结果的准确性和可靠性，因此具有良好计量学特性的柠檬苦素有证标准物质对相关的检测分析非常重要。基于以上，本研究首先以柑橘废弃物柑橘籽为原料，采用高效绿色的天然低共熔溶剂(Natural deep eutectic solvents,NADESs)对柠檬苦素类化合物提取工艺进行优化，再利用大孔树脂吸附结合反溶剂结晶法分离纯化出高纯度的柠檬苦素单体，为进一步的开发和利用提供基础;根据国家标准物质相关技术规范，制备得到柠檬苦素纯度标准物质，并考察其均匀性和稳定性;最后对纯化出的柠檬苦素进行微胶囊化研究，并考察体外模拟胃肠消化过程中其释放特性和抗氧化性。以上研究为柠檬苦素的提取、纯化以及微胶囊化提供新的方法和思路，也为柑橘资源开发与利用提供数据支持和科学依据。本论文的主要研究内容如下: (1)天然低共熔溶剂提取柑橘籽类柠檬苦素的工艺优化 以氯化胆碱为氢键受体，结合四类氢键供体(有机酸、多元醇、糖和胺)，按照一定摩尔比混合获得13种NADESs。采用超声辅助NADESs提取柑橘籽中类柠檬苦素，并以柠檬苦素、诺米林和黄柏酮三种柠檬苦素类化合物的总得率作为评价指标，结果表明:以氯化胆碱∶甲酸(1∶4，n/n)为溶剂时，提取效果最佳。在此基础上，以含水量、液固比、提取时间、提取温度为主要影响因素，采用响应面法优化提取条件，最终获得从柑橘籽中提取柠檬苦素类化合物的最佳条件为:含水量12％(v/v)、液固比10mL/g、提取时间34min、提取温度60℃。此外，利用大孔树脂吸附结合反溶剂结晶法分离纯化柠檬苦素，得到纯度为98.35％的柠檬苦素单体。 (2)柠檬苦素纯度标准物质的研制 分别利用核磁共振氢谱(1HNMR)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和质谱(MS)对柠檬苦素进行初步定性确认，再通过重结晶法提纯制备柠檬苦素纯度标准物质。基于柠檬苦素及其杂质的响应情况，考察了高效液相色谱(HPLC)的色谱柱、流动相、样品浓度、检测波长等条件，得到最佳HPLC检测条件为:色谱柱，SB-C18柱(250mm×4.6mm,5.0μm);流动相，乙腈∶水=38∶62;流速，1mL/min;样品浓度，500mg/L;柱温，30℃;进样量，10μL;检测波长，210nm。经过重结晶处理后，柠檬苦素纯度由98.01％提高到99.48％。采用质量平衡法(MB)和定量核磁法(qNMR)分别对柠檬苦素样品进行定值。HPLC法测得主成分含量为99.48％、水分含量为0.3082％、残留溶剂含量为0.0136％、无机杂质含量为0.0511％,因此质量平衡法定值结果为99.11％,结合定量核磁法定值结果(99.13％),柠檬苦素纯度标准物质最终定值结果为99.12％。使用HPLC对标准物质的均匀性和稳定性进行检验，并对研制过程开展不确定度评定。结果表明:所制得的柠檬苦素纯度标准物质具有较好的均匀性和稳定性，纯度定值为99.12％,扩展不确定度U=0.43％,有效期6个月。 (3)柠檬苦素的微胶囊化 选择壳聚糖(Chitosan,CS)为载体，三聚磷酸钠(Sodium tripolyphosphate,TPP)为交联剂，制备出柠檬苦素纳米微胶囊，重点考察CS浓度、CS溶液pH和CS与TPP质量比等因素对包埋率的影响。通过正交实验确定制备柠檬苦素纳米微胶囊的最佳工艺为:CS浓度，1.5mg/mL;CS溶液，pH4.5;CS与TPP质量比，5∶1。FTIR表征显示，纳米微胶囊中有柠檬苦素的存在，说明纳米微胶囊包埋成功。得到的纳米微胶囊平均粒径为293.75nm,包埋率48.97％,尺寸分布较为均匀。体外模拟消化过程实验表明，5h时柠檬苦素纳米微胶囊比柠檬苦素释放量降低9.59％，并还能持续释放，且纳米微胶囊清除DPPH自由基的能力是柠檬苦素的1.14～1.38倍。
NETL