摘要
桑树是我国的乡土树种，具有重要的生态经济价值，随着染色体水平桑树基因组的陆续公布，桑树的研究随之迈入后基因组时代，为深入解析桑树基因功能提供了可能。然而，基因功能研究体系的缺失限制了桑树学科发展。基于根癌农杆菌的桑树遗传转化方法能在印度桑K2实现，但国内未见相关报道;基于发根农杆菌的桑树转化方法近年来得到广泛应用，尽管该体系较为成熟，但仅限于在根中应用而不能获得地上部转基因材料，限制了该方法的应用。为解决遗传转化困难物种的研究困境，研究人员相继开发出植物病毒载体、纳米介导的遗传转化体系、植物发育调控因子等方法。其中植物病毒载体具有耗时短、宿主范围广、易于遗传操作、可自主复制增殖、高量表达目标基因等优点，已在许多物种中得到广泛应用。植物病毒载体可分为RNA型载体和DNA型载体，均在桑树中有相关报道，但上述研究局限于基因沉默研究，因此本研究利用实验室前期报道的桑花叶型萎缩病相关病毒（Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV）载体，进一步开展了桑树的基因上调、下调和敲除研究，为桑树基因功能研究提供技术手段。本研究构建了基于MMDaV的基因超量表达、沉默和编辑载体，成功在桑树中表达绿色荧光蛋白基因（Green fluorescent protein,GFP）、Cas9,并沉默桑树八氢番茄红素脱氢酶基因（Phytoene desaturase,PDS）MaPDS,为研究桑树基因功能提供新的策略。获得的主要研究结果如下: 1、桑树超量表达体系的构建 基于MMDaV的复制原理，我们首先构建了 MMDaV复制子系统（MMDaV-based replicon Vector,MV）,选择GFP对MV系统的功能进行可视化验证。将携带35S-GFP表达盒的MV载体通过农杆菌侵染法接种烟草和桑树叶片两天后，能在接种叶片中观察到显著绿色荧光，这表明MV载体能侵染烟草和桑树，并表达外源基因。接种三天后，烟草叶片开始坏死，而桑树叶片生长正常，这表明MV载体具有在桑树发挥功能的潜力。与不含MV系统的GFP载体相比，MV-GFP载体接种桑树中GFP表达水平更高，这表明MV系统的存在能提高外源基因的表达量。为了在桑树系统叶中研究基因的功能，我们在MV系统中分别插入MMDaV病毒的全部或部分组分，构建MV-MMDaV系统和MV-MMDaVm系统。通过农杆菌侵染法在桑树上接种后，我们发现注射叶和系统叶都观察到显著绿色荧光，PCR扩增基因组在注射叶和系统叶中都检测到病毒，表明MV-MMDaV系统和MV-MMDaVm系统均能在桑树中实现系统运输、具有系统侵染能力。提取注射叶和系统叶基因组DNA进行重测序，利用重测序数据我们分别组装出两份环状病毒复制子序列，发现两个注射叶和系统叶中复制子拷贝数存在明显差异。综合考虑表达水平和系统侵染，本研究改造的MV-MMDaVm系统和MV系统具有良好效果，特别是MV-MMDaVm系统能有效地实现外源基因在桑树中的系统性超量表达。因此，本研究成功利用MMDaV病毒构建了桑树超量表达体系，为快速高效研究桑树基因的功能奠定了坚实的基础。 2、桑树基因沉默体系的优化 实验室前期利用MMDaV侵染性克隆和辅助载体构建的桑树沉默体系得到了成功应用，效率也有待进一步提升，为了提高沉默效率、简化方法，本研究中我们利用MV系统优化了桑树基因沉默体系，选择MaPDS作为目的基因对VIGS（Virus Induced Gene Silencing）载体的功能进行验证。通过农杆菌侵染法在桑树中接种MV-MaPDS病毒沉默载体后，我们发现接种桑叶中能检测到病毒，进而通过qPCR分析发现，接种桑叶的MaPDS基因的表达水平显著下调，这表明MV载体能在桑树中诱导内源基因的沉默。为了在桑树中实现系统沉默，我们分别在MV系统中插入参与病毒运动的组分以及包裹和运动的组分，命名为MV-MP和MV-MC,同样选择MaPDS作为目的基因对VIGS载体的功能进行验证。通过农杆菌侵染法接种桑树后，发现接种叶均能检测到MMDaV病毒组分，接种MV-MC-MaPDS载体的桑树系统叶中检测到病毒组分。进而通过qPCR分析MaPDS的表达水平，发现三种载体均能诱导MaPDS的沉默，沉默比例分别为71.4％、100％和100％,沉默效率分别为37％-73％、42％-89％和24％-82％。综合比较三个载体的沉默效率，发现MV-MC系统的沉默效率最高，其次为MV系统和MV-MP系统。虽然上述三个沉默载体都能在桑树中诱导MaPDS下调，但始终未观察到PDS沉默后的光漂白表型，推测其原因在于出现漂白表型需要MaPDS的表达水平下调到15％以下。为进一步验证MV-MC系统的沉默功能，我们在烟草中利用GFP观察沉默效率，在同一张叶片中同时分别接种MV-MC-GFP沉默载体和MV-MMDaVm-GFP超量表达载体中的一个或者两个，发现只接种MV-MMDaVm-GFP超量表达载体时GFP的荧光信号最强，同时接种MV-MMDaVm-GFP超量表达载体和MV-MC-GFP沉默载体时GFP的荧光信号明显减弱，这表明MV-MC系统能在烟草中诱导目的基因的沉默。因此，本研究优化的MV-MC系统能在桑树和烟草中分别实现内源基因和外源基因的基因沉默，为进一步研究桑树基因的功能提供了技术手段。 3、桑树基因编辑体系的初探 在桑树超量表达体系的基础上，我们在MV-MMDaV表达系统和MV-MMDaVm表达系统中插入35S-Cas9表达盒获得病毒诱导的基因编辑（VIGE）载体，命名为 MV-MMDaV-Cas9 载体和 MV-MMDaVm-Cas9 载体。将 MV-MMDaV-Cas9载体和MV-MMDaVm-Cas9载体通过农杆菌侵染法接种桑树叶片后，我们发现PCR扩增基因组和cDNA能在接种植株检测到病毒和Cas9,表明VIGE载体能在桑树中表达Cas9,为基因编辑体系的构建提供了基础。以MaPDS为sgRNA靶基因构建sgRNA表达盒，并将其插入MV-MMDaV-Cas9载体和MV-MMDaVm-Cas9载体形成靶向MaPDS的基因编辑载体，用农杆菌侵染法在桑树中接种后，通过PCR扩增基因组检测基因编辑，我们检测了 15株接种植株的64张叶片未发现编辑事件，推测其原因可能在于采用的sgRNA启动子有待进一步优化。本研究对桑树基因编辑体系进行了初步的探索，病毒表达载体介导的Cas9在桑叶中的表达为桑树基因编辑体系的建立奠定了基础，为后续基因编辑体系完善提供了思路。 总之，本研究成功建立MMDaV介导的超量表达和基因沉默体系，可通过上调和下调在桑树中研究目的基因的功能，能突破制约桑树基因功能研究的瓶颈，将有力促进桑树基因功能研究，也为其他遗传转化困难的物种提供参考。
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