摘要
目的: 1.明确清热解毒化湿中药（黄连解毒汤）对胰腺癌的调控作用，并阐明其潜在的分子机制; 2.初步验证黄连解毒汤通过调控IL-17通路重塑不完全热消融后炎症免疫微环境，发挥抗胰腺癌的作用机制; 3.明确胰腺癌热消融联合标准化疗的最佳治疗方案及其影响因素，进一步分析联用清热解毒化湿中药干预后胰腺癌患者生存期的差异。 方法: 1.通过细胞增殖实验（CCK-8法）、平板克隆形成实验、Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测、碘化丙啶（PI染液）流式检测、划痕实验、Transwell迁移实验分别验证黄连解毒汤（HLJDT）对胰腺癌细胞Capan-1、Panc02细胞增殖、克隆形成、细胞凋亡、细胞周期以及迁移运动能力的影响;同时采用鼠Panc02细胞株，建立C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型，将小鼠随机分成4组，分别为对照组，HLJDT 50mg/kg、100 mg/kg、200mg/kg,即低、中、高剂量组。分组后开始给药干预，对照组灌胃生理盐水0.2mL,实验组分别灌胃HLJDT低、中、高浓度0.2mL,连续给药21天。皮下瘤接种第4天开始，每周两次测量小鼠的瘤体的长径和短径，及小鼠的体重，第22天杀鼠取瘤。将取瘤一部分放入4％PFA中浸泡48 h后制备石蜡切片、并进行H&E染色、免疫组化及荧光染色等后续实验，一部分放入液氮中保存。瘤体积计算公式:瘤体积=长径×短径×短径/2。 2.借助TCMSP数据库寻找HLJDT的有效化合物活性成分，根据（OB≥30％,DL≥0.18）进行筛选;借助Uniprot数据库转换HLJDT有效成分对应的靶蛋白为靶基因，并在Cytoscape 3.7.2软件中构建“药材-有效成分-靶基因”网络图;在Metascape网站中对HLJDT的278个靶基因进行KEGG通路富集分析;在DAVID数据库分析HLJDT的278个靶基因寻找药物的作用靶点;从GEO数据库中筛选出胰腺癌差异表达基因及网络药理学手段所发现的HLJDT的靶基因分别输入到Venny 2.1中，通过合并后的韦恩图筛选HLJDT与胰腺癌的重复靶基因，并通过STRING网站进行蛋白互作分析;借助RNA-seq对HLJDT干预的C57BL/6小鼠皮下移植瘤进行转录组测序，并用R语言(R4.1.2)绘制出火山图、热图、气泡图和关联通路富集聚落分析图。 3.建立C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型，待肿瘤直径8-10 mm时进行热消融处理，分别设置假手术组(定义为:NC组)和不完全热消融组(Incomplete microwave ablation,iMWA)，采用南京维京医疗公司生产的水冷微波消融设备，配备有直径17 G的水冷内循环微波发射天线，频率为2450 MHz的微波发射源以及输出功率范围为(5-40 W)进行微波热消融，iMWA组采用10 W 30 sec处理，NC组采用0 W 30 sec处理。治疗之后每隔3天检测肿瘤重量和体积，观察各处理条件下瘤体的生长情况，并在第0天、1天、7天和14天时收集组织样本，对小鼠血清进行ELISA分析，对肿瘤组织进行石蜡包埋切片、免疫荧光染色、同时行RNA提取、转录组分析。进一步研究HLJDT对iMVA后的联合治疗作用，随机分为4组，即对照组、NC组、iMWA组以及iMWA联合HLJDT治疗组。假手术组、iMWA组采用上述方式处理。iMWA联合HLJDT治疗组，采用10W 30 sec处理后，术后第1天起采用HLJDT 200 mg/kg灌胃处理，每天给药0.2mL;NC组、iMWA组及对照组均为术后第1天同一时间起，每天灌胃生理盐水0.2 mL;以上4组均连续给药14天，给药期间每隔3天检测量肿瘤体积，观察各组瘤体的生长情况，并在第0天、7天和15天时收集瘤体组织样本及血清样本，对小鼠血清进行ELISA分析，对肿瘤组织进行石蜡切片、免疫荧光染色、同时行RNA提取、转录组分析。 4.回顾性分析192例复旦大学附属肿瘤医院接受化疗联合局部热消融治疗的不可切除胰腺癌患者的临床资料，所有统计分析均使用Statistical Package Social Science Version 19.0(SPSS,Inc.)进行。正态分布的连续变量表示为平均值±标准差(Standard deviation，SD)，并通过t检验进行分析。分类变量以频率(％)表示，相关性通过Pearson卡方检验确定。总生存期(OS)从病理诊断之日到死亡或最后一次随访之日计算。Kaplan-Meier法用于比较不同组患者的OS,时序检验用于评估预后因素与生存率的关系。使用Cox比例风险回归模型进行单变量和多变量分析，以确定生存的独立预后因素。Cox回归模型估计的风险比(Hazard ratio,HR)被报告为具有相应95％置信区间(Confidence interval,CI)的相对风险。p＜0.05被认为具有统计学意义。使用统计软件包R4.1.2绘制Cox回归模型的列线图分析拟合。将标准化疗前先行热消融治疗定义为A组，标准化疗后行热消融治疗定义为B组，评估局部热消融治疗对患者预后的影响，以及局部热消融联合清热解毒化湿中药对患者预后的影响。 结果: 1.HLJDT可以在体外抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，诱导胰腺癌细胞凋亡和细胞周期阻滞，其中，HLJDT 100 μg/mL及200 μg/mL可抑制人胰腺癌Capan-1细胞及小鼠胰腺癌Panc02细胞的克隆形成能力(p＜0.001，p＜0.0001);HLJDT 100 μg/mL 及 200 μg/mL 作用 24、48 h 后可以明显降低Capan-1 及 Panc02 细胞的迁移能力(p＜0.05);HLJDT 100μg/mL 及200μg/mL作用48 h后可以明显降低Capan-1及Panc02细胞的侵袭能力，且在该浓度范围内呈剂量依赖性(p＜0.05);HLJDT 100 μg/mL及200 μg/mL处理48 h后可以诱导Capan-1及Panc02细胞凋亡，呈现剂量依赖性(p＜0.05)，在HLJDT 200 μg/mL干预48 h后，Capan-1细胞中凋亡细胞的比例为37.0％,Panc02细胞中凋亡细胞的比例为36.0％。在体内，HLJDT 50 mg/kg,100 mg/kg及200mg/kg灌胃处理后与生理盐水对照组相比，可以抑制C57BL/6小鼠皮下移植瘤的生长(p＜0.01，p＜0.0001，p＜0.0001),并且对小鼠体重(p＞0.05)及重要脏器组织形态无明显影响。免疫荧光染色观察小鼠肿瘤组织内M2巨噬细胞的数量发现HLJDT 50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg组的CD68+CD163+,即M2型巨噬细胞的数量较对照组显著减少(p＜0.001，p＜0.0001,p＜0.0001)。实验结果提示，HLJDT在体外，可抑制胰腺癌的增殖、迁移及侵袭能力，诱导细胞凋亡;在体内可抑制小鼠皮下移植瘤生长，并且显著减少小鼠肿瘤组织内M2巨噬细胞的数量，初步观察到HLJDT抑制抑制胰腺癌的作用可能与其作用于肿瘤炎性免疫微环境相关。 2.筛选出HLJDT中活性药物成分75个，活性成分对应的靶基因共278个，其中黄连共14个有效成分，黄芩共30个有效成分，黄柏共37个有效成分，栀子共23个有效成分，并构建“药材-有效成分-靶基因”网络图。HLJDT的278个靶基因KEGG通路富集分析结果提示:作用通路前3名分别为癌症通路、AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路;DAVID数据库分析结果提示HLJDT药物作用疾病的前3名分别为免疫疾病，药理药效和肿瘤。韦恩图提示HLJDT与胰腺癌的重复靶基因共有47个。HLJDT干预的C57BL/6小鼠皮下移植瘤转录组测序分析结果显示:HLJDT共上调了 700个基因，下调了 792个基因(p＜0.05)，得到靶基因的KEGG通路富集于IL-17信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体交互作用等通路。揭示HLJDT可能通过调控IL-17 相关通路抑制胰腺癌的进展。 3.iMWA能够改变胰腺癌局部微环境，导致血清中细胞因子TNF-a上升(p＜0.01)、GM-CSF 下降(p＜0.01),CSF-1 上升(p＜0.01)和 TGF-β 上升(p＜0.01)，促进肿瘤的生长(p＜0.01)。iMWA同时施加HLJDT观察胰腺癌小鼠皮下移植瘤发现，HLJDT可以明显抑制iMWA所诱导的炎症免疫微环境，从而抑制小鼠皮下移植瘤的生长(p＜0.01),并进一步通过RNA-seq及免疫组化结果分析发现，iMWA后上调的IL-17通路也受到HLJDT所抑制。 结论: 1.HLJDT可在体外抑制胰腺癌细胞株增殖、迁移及侵袭，并促进胰腺癌细胞株凋亡;并可在体内抑制小鼠皮下移植瘤的生长;进一步分析HLJDT可通过调控IL-17改善免疫微环境抑制胰腺癌小鼠皮下移植瘤的生长。 2.HLJDT可以拮抗由iMWA所诱导的IL-17表达上调，改变肿瘤局部炎症免疫微环境，抑制胰腺癌小鼠皮下移植瘤的生长。 3.不可切除的晚期胰腺癌综合治疗中，采用化疗前先行局部热消融治疗优于化疗后行局部热消融治疗。清热解毒化湿中药的联合应用有助于延长部分胰腺癌患者的中位生存期，但仍需要后续临床研究的进一步分析。
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