摘要
朱砂叶螨是一种对农作物危害严重的农业害螨，繁殖能力强、抗药性严重等问题使其极难防控。植物次生代谢物在农业害螨防控中表现出巨大的潜力。天然香豆素类化合物滨蒿内酯既可从药用植物（茵陈蒿）中提取，又可化学合成，其具有杀螨活性高，对非靶标生物及环境安全的优点，在害螨的防治中具有广阔的应用前景。microRNA（miRNA）是生物体内调控基因表达的重要因子，可通过调控害螨体内关键基因的转录调节生殖、发育、生长、代谢甚至可诱导害螨死亡，是害螨高效防治的潜在靶点。本研究旨在解析miRNA介导的滨蒿内酯对朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）杀螨作用的分子靶标和作用机理，为探索高效先导杀螨剂和创制绿色、安全、友好型天然产物杀螨剂提供理论指导。主要研究结果如下: 1 筛选了滨蒿内酯对朱砂叶螨杀螨机制相关的候选miRNA RNA-Seq结果表明，在滨蒿内酯胁迫处理48 h后，有179个miRNA显著差异表达，其中，128个miRNA上调，51个miRNA下调。同时，GO和KEGG分析发现“钙信号通路”相关的功能为显著富集的条目，表明介导钙信号通路相关差异表达的miRNA可能是滨蒿内酯杀螨作用的关键靶点，并筛选出miR-263b-5p_1作为候选miRNA进行下一步研究。 2 验证了 miR263b-5p_1在滨蒿内酯胁迫下差异表达模式 采用qPCR检测了 miR-263b-5p_1在滨蒿内酯胁迫下的表达情况，结果表明，滨蒿内酯显著激活miR-263b-5p_1的表达，表明该miRNA介导了滨蒿内酯对朱砂叶螨的杀螨机制。 3 证明了 miR263b-5p_1靶向调控TcVGCC基因的表达 对miR-263b-5p_1靶基因进行预测，获得tetur08g04060（命名为TcVGCC）等18条候选mRNA。进一步采用模拟物（mimic）饲喂法和qRCR方法，验证了 miR-263b-5p_1与所预测mRNA的靶向关系，结果表明:miR-263b-5p_1 mimic被饲喂后，朱砂叶螨体内miR-263b-5p_1的表达量比处理前增加了 47.12％,同时候选靶基因中TcVGCC表达量降低了 39.27％,表明TcVGCC可能是miR-263b-5p_1的靶标基因，并呈现为靶向负调控的关系。 4 明确了 miR263b-5p_1对TcVGCC基因的靶向调控位点 朱砂叶螨饲喂miR-263b-5p_1 mimic 后,TcVGCC表达量下调了 41.14％;此外，饲喂miR-263b-5p_1 inhibitor后，TcVGCC表达量上调了 59.46％,表明miR-263b-5p_1靶向负调控TcVGCC基因的表达:同时，双荧光素酶验证结果表明，TcVGCC的3''非编码区（3''UTR）与miR-263b-5p_1互补结合发挥调控作用的具体位点是miR-263b-5p_1的2到20位碱基与TcVGCC非编码区的112到134位进行互补配对。 5 证实了miR-263b-5p_1靶基因TcVGCC介导了滨蒿内酯对朱砂叶螨的杀螨机制 进化树分析表明,TcVGCC与姐妹物种二斑叶螨亲缘关系最近，而与哺乳动物亲缘关系远;qPCR和RT-PCR分析表明，TcVGCC基因在朱砂叶螨所有发育阶段都有表达。 RNAi结果表明，饲喂TcVGCC-dsRNA后，TcVGCC的表达量降低了 40.32％:且TcVGCC沉默后，朱砂叶螨对滨蒿内酯敏感性增强，LC50下降了 23.38％,这表明TcVGCC介导了滨蒿内酯对朱砂叶螨的杀螨机制。 敏感性检测表明，饲喂 miR-263b-5p_1mimic后,其 LC50降低了 60.43％,饲喂 miR-263b-5p_1 inhabitor后，其LC50升高了 87.05％，进一步证明了 miR-263b-5p_1介导了滨蒿内酯对朱砂叶螨的杀螨分子机制。这些结果证实了 miR-263b-5p_1通过靶向负调控TcVGCC基因的表达，从而介导了滨蒿内酯对朱砂叶螨的杀螨活性。 综上所述，本研究明确了滨蒿内酯的作用方式涉及miR-263b-5p_1靶向负调控TcVGCC 基因的表达:阐明了 miR-263b-5p_1介导蒿内酯对朱砂叶螨杀螨作用的靶标位点。本研究将为开发基于miR-263b-5p_1的靶标特异性绿色杀螨化合物提供理论基础。
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