摘要
结肠癌(Coloncancer,CC)是全球高发病率及死亡率的恶性肿瘤之一。肿瘤转移是结肠癌患者预后差的主要原因，严重影响患者的生活质量。抗血管生成是近年来发现的肿瘤靶向治疗手段，其中贝伐珠单抗已作为转移性结肠癌患者的临床一线治疗药物，但临床研究发现仍有一部分患者并不能受益于贝伐珠单抗靶向治疗或出现耐药问题。因此，还需寻找更多抗肿瘤血管生成途径。 近年来研究证实外泌体参与多种实体瘤发展进程，所携带的“货物”如非编码RNA等具有潜力成为肿瘤靶点。早期报道环状RNA(CircularRNA,circRNA)在外泌体内显著富集。CircRNA是一类不易被降解的环状非编码RNA,其表达模式具有组织及细胞特异性。研究证实circRNA在结肠癌恶性进展中起关键调控作用，极有潜力成为结肠癌分子标志物“候选者”。但目前关于结肠癌细胞来源的外泌体(CCcell-derivedexosomes，CC-CDEs)内circRNA影响肿瘤血管生成的报道较少，其调控的分子机制也不清楚。因此，本研究主要探索CC-CDEs内circRNA对结肠癌血管生成的影响及其调控的分子机制，为肿瘤血管生成提供新思路，为今后转移性结肠癌抗血管生成治疗提供新靶点。 为探索CC-CDEs对结肠癌血管生成的影响，本研究首先明确了CC-CDEs对血管内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)功能的调控。结果显示，经超高速离心提取的CC-CDEs可在短时间内进入HUVECs胞浆内，从而促进HUVECs的迁移及管腔形成。尖端细胞是血管生成过程中的“指引者”，可通过产生大量微丝引导血管生成。本研究发现CC-CDEs可诱导HUVECs的微丝形成，导致HUVECs尖端化标志物—CD34及CXCR4高表达。生物信息学分析显示高表达的CD34及CXCR4与结肠癌转移有关且预示不良预后。 为探索CC-CDEs内circRNA对结肠癌血管生成的调控作用及机制，本研究利用circRNA芯片测序技术检测了8例来自转移及非转移结肠癌患者血清内的外泌体circRNA(ExosomalcircRNA,exo-circRNA)以及结肠癌细胞上清内exo-circRNA。同时，本研究也分析了外泌体公共数据库内的exo-circRNA数据，最终筛选到来自CC-CDEs的高表达circ101501，即circTUBGCP4。GEO数据库及临床队列结果显示circTUBGCP4在结肠癌中高表达，且与肿瘤组织内微血管密度(Microvesseldensity,MVD)及转移呈正相关。为进一步探索exo-circTUBGCP4的调控作用，本研究提取了敲低circTUBGCP4稳转结肠癌细胞系的外泌体。利用Transwell、管腔形成、细胞划痕、免疫荧光及Westernblot技术证实敲低exo-circTUBGCP4后抑制HUVECs迁移、管腔形成及尖端化，并在体内证实敲低exo-circTUBGCP4抑制结肠癌血管生成及肿瘤转移。此外，本研究构建了过表达circTUBGCP4质粒，通过体外瞬时转染circTUBGCP4质粒观察HUVECs功能的改变。结果显示，过表达circTUBGCP4可促进HUVECs迁移、管腔形成及尖端化。体内实验证实过表达circTUBGCP4后可促进结肠癌血管生成。以上实验结果证实exo-circTUBGCP4促进结肠癌血管生成，但其调控的分子机制还需进一步探索。 Argonaute2(AGO2)蛋白是RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)的核心成分，可与MicroRNA(miRNA)形成复合体后参与基因沉默调控机制。本研究利用公共数据库及RNA免疫共沉淀(RNAimmunoprecipitation,RIP)实验发现circTUBGCP4与AGO2蛋白存在结合位点。进一步通过CircInteractome网站、circRNA测序结果、RNApulldown实验及双荧光素酶报告基因实验证实circTUBGCP4可与HUVECs内miR-146b-3p结合。临床数据及功能实验证实:在结肠癌中低表达的miR-146b-3p与结肠癌呈负相关;在体外过表达miR-146b-3p后可抑制HUVECs的迁移及管腔形成。生信预测、RNApulldown及双荧光素酶报告基因实验证实:miR-146b-3p可靶向磷酸化AKT的上游分子——丙酮酸脱氢酶激酶2(Pyruvatedehydrogenasekinase2，PDK2)。QPCR及Westernblot证实circTUBGCP4可通过靶向抑制miR-146b-3p从而促进PDK2的表达，激活AKT通路。为探索exo-circTUBGCP4是否通过miR-146b-3p影响HUVECs的功能，本研究提取了过表达circTUBGCP4稳转细胞系的外泌体联合miR-146b-3pmimic进行补救实验。补救结果显示:exo-circTUBGCP4可通过靶向抑制miR-146b-3p促进血管内皮细胞迁移、管腔形成及尖端化。 综上，本研究发现了CC-CDEs被血管内皮细胞吸收后促进HUVECs迁移、管腔形成及尖端化;并证实了结肠癌细胞来源的exo-circTUBGCP4通过靶向miR-146b-3p促进结肠癌血管生成的功能及分子机制。本研究为探索结肠癌血管生成分子机制提供理论支撑，为转移性结肠癌抗血管生成治疗提供新思路。
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