摘要
背景:银屑病是一种自身免疫性皮肤病，影响全球约1.25亿人，其中97％以上患者表现为寻常型银屑病。遗传易感个体暴露于微生物感染、物理创伤等环境时，树突状细胞异常激活产生各种细胞因子，招募T细胞、中性粒细胞等免疫细胞浸润到病变的皮肤中，导致炎症级联反应和银屑病皮损形成。对于寻常型银屑病患者的治疗，外用药物治疗是主要治疗手段之一，特别是对于轻中度银屑病患者，首选外用药物治疗;中重度银屑病患者在系统治疗的同时，往往辅于外用药物治疗。然而，现有可选择的外用药物有限，且长期应用时存在一些不良反应，如皮肤刺激、血管扩张、皮肤萎缩和耐药性，导致患者依从性差、治疗效果不理想甚至停药。因此，开发治疗银屑病的新型外用药物具有重要的意义。 金诺芬是一种口服的含金化合物，自1985年以来一直用于治疗类风湿性关节炎，但其潜在机制尚不清楚。既往研究表明，金诺芬通过抑制巨噬细胞释放细胞因子，如IL-6、IL-8、IL-12等，进而发挥免疫调节作用。同时金诺芬还可以抑制NF-κB信号通路和STAT3信号通路的激活。一些临床研究显示，金诺芬可能对银屑病关节炎有治疗作用。基于以上背景，我们推测金诺芬可能是一种潜在的银屑病治疗药物。 目的:本研究旨在明确金诺芬是否可以治疗寻常型银屑病，同时阐明其治疗寻常型银屑病的具体分子机制，为银屑病的治疗提供新的思路。 方法:1.金诺芬对M5刺激的银屑病样角质形成细胞的作用:通过IL-17A、IL-22、抑瘤素M、IL-1α、TNF-α混合的促炎因子（M5）刺激角质形成细胞，构建银屑病样角质形成细胞模型，不同浓度金诺芬处理银屑病样角质形成细胞，探索金诺芬对银屑病样角质形成细胞生物学功能的影响。①通过CCK8实验检测金诺芬对银屑病样角质形成细胞增殖的影响;②通过流式细胞术检测金诺芬对银屑病样角质形成细胞凋亡的影响;③金诺芬或对照溶剂处理M5刺激的银屑病样角质形成细胞，提取总RNA，进行RNA测序分析，根据KEGG富集分析的结果，探索金诺芬调控银屑病样角质形成细胞功能异常相关通路;④通过RT-qPCR检测金诺芬对银屑病样角质形成细胞中炎症相关基因mRNA表达水平的影响。 2.探究外用金诺芬对咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病样皮炎的影响:6-8周龄雌性Balb/c小鼠，背部脱毛后被随机分成健康对照组、溶剂治疗组及金诺芬治疗组。每天给小鼠脱毛区域涂抹IMQ软膏62.5mg,间隔8小时给各组小鼠脱毛区域涂抹药物溶剂100μL(含丙酮75μL、橄榄油25uL)或金诺芬溶液100uL(丙酮75μL、橄榄油25uL，含2mg/kg金诺芬)，连续涂抹6天。①在小鼠的造模期间拍照记录各组小鼠皮损的动态变化情况;②在造模的第7天处死各组小鼠，然后取背部皮损组织进行HE染色分析其组织病理学改变并进行量化评分;③多光谱免疫组化染色、流式细胞术分析金诺芬对皮损组织中炎症细胞浸润的影响;④提取溶剂治疗组和金诺芬治疗组皮损组织的RNA，进行转录组测序(RNA-seq),对差异基因进行KEGG富集分析。 3.金诺芬治疗IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎的机制研究。①金诺芬处理的M5刺激的角质形成细胞RNA-seq差异表达基因与金诺芬治疗的小鼠银屑病样皮损组织RNA-seq差异表达基因作交集，寻找金诺芬作用的关键靶基因;②RT-qPCR和Westernblot检测IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损中脂肪酸2-羟化酶(Fattyacid2-hydroxylase,FA2H)的表达;③RT-qPCR、Westernblot检测FA2H在寻常型银屑病患者皮损中的表达，免疫组织化学染色技术检测FA2H在寻常型银屑病患者皮中的定位;④在角质形成细胞中干扰和过表达FA2H后，通过RT-qPCR检测FA2H的表达，通过流式细胞术检测FA2H对角质形成细胞增殖和凋亡的影响。 结果:1.与对照组相比，金诺芬能够显著抑制M5刺激的角质形成细胞的增殖(n=3,P＜0.05),促进M5刺激的角质形成细胞的凋亡(n=3,P＜0.05);转录组测序结果分析显示金诺芬能够下调M5诱导的炎症相关通路，抑制炎症相关基因的表达。 2.与溶剂治疗组小鼠相比，金诺芬治疗组能够改善IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎。①金诺芬能够显著改善小鼠银屑病样皮损，降低PASI评分(n=5,P＜0.05);②金诺芬治疗改善小鼠银屑病样皮损表皮棘层肥厚(n=,P＜0.001),减少真皮炎症细胞浸润(n=5,P＜0.0001),减少表皮Ki-67阳性的角质形成细胞(n=3,P＜0.01);③金诺芬减少了IMQ诱导的银屑病小鼠皮损中CD3+T细胞(n=3,P＜0.01),Ly6G+中性粒细胞(n=3,P＜0.01)，Th1细胞(n=5,P＜0.05)和Th17细胞(n=5,P＜0.05)的浸润。④转录组测序结果及生物信息分析显示:金诺芬下调IMQ诱导的银屑病小鼠皮损中炎症相关通路，抑制炎症相关基因的表达。 3.金诺芬促进IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损中FA2H的表达。①金诺芬处理角质形成细胞的差异表达基因与金诺芬治疗的小鼠银屑病样皮损组织的差异表达基因作交集后显示，有38个共同上调的基因，21个共同下调的基因，其中，FA2H表达显著上调(P＜0.0001,|log2FoldChange|=4.9);②金诺芬促进了IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损中FA2H的mRNA表达水平(n=5,P＜0.0001)和蛋白表达水平(n=3,P＜0.001);③与正常人相比，寻常型银屑病患者皮损中FA2H的mRNA(n=19,P＜0.0001)和蛋白(n=3,P＜0.01)表达水平下调，FA2H主要表达在表皮基底层的角质形成细胞中;④角质形成细胞中，抑制FA2H的表达，能够促进角质形成细胞中炎症因子mRNA表达水平，抑制角质形成细胞的凋亡(n=3,P＜0.01),促进角质形成细胞的增殖(n=3,P＜0.01);而促进FA2H的表达，能够抑制角质形成细胞中炎症因子mRNA表达水平，能够抑制角质形成细胞的增殖(n=3,P＜0.01)，促进角质形成细胞的凋亡(n=3,P＜0.05)。 结论: 1.金诺芬抑制银屑病样角质形成细胞的增殖，促进银屑病样角质形成细胞的凋亡，同时下调炎症相关通路，抑制炎症因子的表达; 2.金诺芬通过促进FA2H的表达和抑制炎症反应改善IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎。
NETL