摘要
目的 细胞焦亡（pyroptosis）作为一种程序性的细胞死亡方式，广泛参与各种疾病的病理进展过程。镉（Cadmium,Cd）作为一种重金属，由于生物半衰期长，易于富集于人体内，随着血液循环到达人体的各器官，给人类身体健康带来了严重的损害。目前有关于Cd元素与细胞焦亡之间关系的研究知之甚少，Cd作为一种非常规检验指标，其临床检验诊断价值目前也尚未明确。本研究采用Cd处理人真皮淋巴管内皮细胞（Humandermallymphaticendothelialcells,HDLECs），探讨Cd暴露能否导致HDLECs焦亡的发生及其内在的机制，为研究Cd与淋巴管类疾病之间的关系以及发现Cd的临床诊断价值奠定基础。 方法 1.将传代培养的HDLECs使用不同浓度（0、1、5、10、50和100μM）的Cd暴露处理24小时（h），采用MTT和CCK8细胞增殖实验检测不同浓度Cd对细胞增殖活性的影响程度，并筛选出对细胞增殖活性有显著影响的Cd的最佳使用浓度。 同时，将HDLECs分为对照组和实验组。其中，对照组细胞加入磷酸盐缓冲溶液（Phosphatebuffersaline,PBS），实验组细胞加入Cd（100μM）溶液，于细胞培养箱培养24h，进行以下实验: （1）使用DCFH-DA作为荧光探针标记细胞，用荧光显微镜分别观察对照组和实验组细胞的活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）荧光强度。 （2）分别提取对照组和实验组细胞内的核糖核酸（RibonucleicAcid,RNA），使用实时荧光定量PCR（q-RealtimequantitativePCR,q-RTPCR）方法检测促炎性细胞因子如白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-α,TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（Monocytechemotacticprotein-1,MCP-1）的表达水平。 （3）采用PI和Hoechst33342双染色实验观察HDLECs细胞膜上孔隙的形成情况。 （4）提取细胞内的蛋白质，使用免疫印迹实验（WesternBlot）检测NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白、Casp1p20蛋白、Pro-IL-1β蛋白和IL-1β蛋白表达情况。 （5）用流式细胞术分别检测对照组和实验组细胞中Caspase-1活性以及细胞膜孔隙的形成情况。 2.使用脂质体转染技术将siNC转染对照组细胞，siNLRP3转染实验组细胞，于细胞培养箱培养48h后，使用WesternBlot实验检测细胞NLRP3蛋白表达水平；对细胞进行PI和Hoechst33342荧光染色，使用荧光显微镜对细胞膜上是否有孔隙形成进行观察。 同时，上述方法转染24h后，将对照组和实验组细胞分别加人100μMCd进行暴露处理24h，借助荧光显微镜观察细胞经PI和Hoechst33342染色情况。 结果 1.（1）由MTT实验得出，浓度为1μM的Cd暴露HDLECs后，能明显促进细胞增殖，差异有统计学意义（Plt;0.05）。浓度为5、10和50μM的Cd对细胞的增殖没有明显的作用，差异无统计学意义。较高浓度的Cd（100μM）对细胞有明显的抑制增殖的作用，细胞死亡数比较多，具有明显的细胞毒性，差异有统计学意义（Plt;0.05）。 （2）CCK8实验结果显示，浓度为1μM和50μM的Cd暴露处理细胞后，对细胞的增殖没有明显的作用，差异无统计学意义。浓度为5μM和10μM的Cd对细胞增殖有明显的促进作用，差异有统计学意义（P值分别为Plt;0.01、Plt;0.001）。而高浓度的Cd（100μM）对细胞有明显的抑制增殖的作用，具有细胞毒性，与MTT实验结果相一致，差异有统计学意义（Plt;0.05）。 2.将HDLECs于100μMCd中暴露24h之后 （1）荧光显微镜下观察到ROS的荧光强度明显增强，差异有统计学意义（Plt;0.01）。 （2）IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1表达水平明显增高，差异有统计学意义（Plt;0.01）。IL-8表达水平增高超过8倍（Plt;0.001），差异有统计学意义。 （3）对细胞膜上的孔隙进行检测显示，对照组细胞发出强烈的蓝色荧光和微弱的红色荧光，而实验组细胞发出强烈的蓝色荧光和红色荧光，差异有统计学意义（Plt;0.01）。 （4）WesternBlot结果表明NLRP3蛋白、Casp1p20蛋白、Pro-IL-1β蛋白，IL-1β蛋白表达量显著增高。 （5）流式细胞术结果显示细胞中Caspase-1活性和阳性GreenLive/DeadStain染色双阳性率升高，差异有统计学意义（Plt;0.01）。 3.（1）细胞转染siNLRP3与siNC后，WesternBlot结果表明，si-NLRP3转染组与si-Ctrl转染组相比，NLRP3蛋白和Casp1p20蛋白表达量下降。 （2）细胞转染siNLRP3与siNC后，PI/Hoechst33342染色结果表明，si-Ctrl+Cd转染组与si-Ctrl转染组相比，荧光强度明显增加，差异有统计学意义（Plt;0.05）。si-NLRP3+Cd转染组与si-NLRP3转染组相比，荧光强度无明显变化，差异无统计学意义。 结论 1.Cd暴露使HDLECs的增殖率明显下降，且导致了HDLECs内ROS的产生，因此，Cd暴露对HDLECs产生了细胞毒性作用。 2.Cd暴露的HDLECs细胞膜孔隙形成增加，细胞内释放的促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1表达增加；并且，Cd暴露使细胞焦亡关键蛋白Casp1p20增加，因此，Cd暴露导致HDLECs发生了焦亡。 3.Cd暴露引起的HDLECs焦亡依赖于NLRP3炎症小体。
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