摘要
D-阿洛酮糖是一种高甜度、低能量的稀有糖，在食品和医药行业拥有巨大的应用潜力。目前，D-阿洛酮糖的生产主要依赖于生物合成法。然而，无论是基于酶催化法还是微生物发酵法，其底物只能选用D-果糖或D-葡萄糖，且全部遵循Izumoring异构化原理。此外，D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化皆为可逆反应，导致底物转化率相对较低。D-木糖是木质纤维素水解产物中仅次于D-葡萄糖的第二组分。大肠杆菌EscherichiacoliJM109(DE3)具有遗传背景清晰、繁殖迅速、培养方便等特点。设想以D-木糖为底物，在大肠杆菌中引入磷酸化-去磷酸化的非可逆路径，可实现D-阿洛酮糖发酵合成。但磷酸戊糖（PP）途径的存在会将果糖-6-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸，从而导致D-阿洛酮糖的产量极低。为此，构建甲醇同化途径理论上可优化D-木糖的利用。甲醇可从二氧化碳化学加氢中获得，是一种有前途的微生物发酵生产辅料，同时也符合国家“碳中和、碳达峰”的战略目标。在此基础上，引入阿洛酮糖单磷酸（AuMP）途径，最终实现D-阿洛酮糖的高效合成。具体研究内容如下： （1）构建从D-木糖和甲醇到D-阿洛酮糖的合成路径。为了偶联甲醇还原途径、磷酸戊糖（PP）途径、磷酸核酮糖（RuMP）途径以及阿洛酮糖单磷酸（AuMP）途径，在E.coliJM109(DE3)中同时过表达mdh、hps、phi、alsE和a6PP五个关键外源基因。通过摇瓶发酵得到≈0.37mMD-阿洛酮糖，得率为≈0.006mM/mM（D-木糖）以及≈0.01mM/mM（甲醇）。然而，蛋白表达实验结果显示AlsE表达水平偏低。 （2）利用融合蛋白标签提高AlsE的表达量，强化AuMP途径。先后构建了6个融合蛋白SUMO-AlsE、DsbA-AlsE、MBP-AlsE、AlsE-GFP、GST-AlsE、NusA-AlsE，通过蛋白表达效果和菌株发酵结果，筛选出融合蛋白SUMO-AlsE。含SUMO-AlsE的菌株发酵后可生产D-阿洛酮糖≈1.04mM，是添加其他标签产量的2~3倍。以果糖-6-磷酸为底物合成D-阿洛酮糖的体外酶催化实验发现，添加融合蛋白SUMO-AlsE的产量是AlsE的4倍，说明AuMP途径得以强化。 （3）依次敲除frmRAB、rpiA、pfkA和pfkB基因，理性调节细胞工厂的碳通量，最大限度地提高D-阿洛酮糖产量。最终，得到重组菌株E.coli(Mdh,Hps,Phi,SUMO-AlsE,A6PP,ΔFrmRAB,ΔRpiA,ΔPfkA,ΔPfkB)。发酵后D-阿洛酮糖产量增加到≈23.9mM，得率增加到≈0.490mM/mM（D-木糖）以及≈0.545mM/mM（甲醇）。
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