摘要
目的：缺氧与实体瘤细胞的增殖分化、能量代谢、耐药性的产生以及其内部新生血管的生成密切相关，缺氧的肿瘤微环境也是CAR-T细胞疗法在实体瘤领域应用的限制因素。本课题设计两种包含不同启动子的缺氧元件组合，利用氯化钴缺氧模型评估其缺氧调节能力，构建靶向GPC3的缺氧诱导型嵌合抗原受体T细胞并对其体外水平的免疫效应进行研究。 方法：设计5拷贝数的缺氧调节元件并分别与最小CMV启动子和巨细胞病毒启动子串联构建两种不同的缺氧元件组合，合成至慢病毒表达载体中，构建缺氧诱导型慢病毒表达载体。通过SOEPCR反应拼接红色荧光蛋白mCherry和氧依赖性降解结构域ODD融合基因。构建单缺氧开关型重组质粒和双缺氧开关型重组质粒，利用氯化钴缺氧模型诱导缺氧表达，通过倒置荧光显微镜和多功能酶标仪对缺氧调节能力进行研究。构建靶向GPC3的缺氧诱导型嵌合抗原受体重组质粒，通过磷酸钙共沉淀法瞬时转染293T细胞包装慢病毒并感染Jurkat细胞，有限稀释法筛选单克隆细胞株，PCR反应和WesternBlot对单克隆细胞株进行鉴定。利用CCK-8法分析靶向GPC3的缺氧诱导型Jurkat细胞株在特异性抗原的刺激后的增殖水平。与GPC3阳性的靶细胞共培后，ELISA分析细胞因子IL-6和TNF-α的分泌水平。 结果：1.成功构建单缺氧诱导型和双缺氧诱导型慢病毒表达载体，并通过红色荧光蛋白mCherry对其缺氧调节能力进行验证。 2.成功构建单缺氧诱导型GPC3-CAR重组质粒，利用磷酸钙共沉淀法包装慢病毒，并成功感染Jurkat细胞，通过嘌呤霉素筛选出缺氧诱导型GPC3-CARJurkat单克隆细胞株，PCR结果显示GPC3-CAR基因的成功整合到Jurkat细胞基因组，WesternBlot结果显示两种缺氧诱导型GPC3-CARJurkat细胞均能表达GPC3-CAR蛋白。 3.通过CCK-8检测两种缺氧诱导型GPC3-CARJurkat细胞的增殖水平：GPC3蛋白对两种缺氧诱导型GPC3-CARJurkat细胞的增殖有促进作用，与GPC3阳性的HepG2细胞共培能促进两种缺氧诱导型GPC3-CARJurkat细胞分泌细胞因子。 结论：成功构建单缺氧诱导型和双缺氧诱导型慢病毒表达载体并验证其缺氧调节能力，所构建的缺氧诱导型CAR-T细胞体外实验中对GPC3抗原有一定程度的免疫反应。本课题基于缺氧这一肿瘤微环境显著特征，设计插入缺氧调节元件组合，以适应CAR-T细胞在实体瘤中的应用，为CAR-T细胞疗法在实体瘤方面的应用提供依据。
NETL