摘要
本研究选取云烟87和CB-1两个品种烤烟，从中筛选可以降解木质素且能够改善烤烟风味的安全菌株，优化其发酵条件，最终成功规模化生产制备酶制剂并应用于烤烟中。通过酶学特性表征，烤烟风味分析以及转录组分析，探讨菌株对烤烟品质产生改良作用的机理。本课题挖掘了烤烟表面可以降解木质素的优势菌株，为开发和利用酶制剂有效提升烤烟品质提供数据支撑和理论指导。主要研究内容和结果如下： （1）木质素降解菌的筛选及发酵条件的优化。从云烟87和CB-1烤烟表面分离得到40株菌，选出6株产酶能力较强的菌株，经测序鉴定确保了菌株的安全性后，通过感官评定筛选得到一株产木质素过氧化物酶（Lip）的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）YY-10可显著提升烤烟品质。YY-10菌株的最适发酵温度为37℃，优化后的产酶发酵培养基配方为烟梗3.00%（w/v），大豆蛋白胨0.25%（w/v），磷酸二氢钾0.10%（w/v），氯化钠0.05%（w/v），硫酸镁0.05%（w/v），氯化钙0.01%（w/v）。在该条件下发酵，酶活提升了1.67倍，烤烟的风味进一步改善。 （2）酶学特性表征与酶制剂的开发。菌株YY-10所产生的Lip的最适反应温度为40℃；该酶在50℃放置2h仍保持50%以上活性，80℃放置2h完全失活；最适反应pH为3，该酶在pH为8的条件下放置1h仍可保持92%的活性；K+对该酶具有激活作用，Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+对酶的抑制作用较强；EDTA、PMSF、SDS、Tween80、CTAB等抑制剂对该酶均有不同程度的抑制作用。将YY-10菌株在2000L发酵罐培养后，通过膜过滤和喷雾干燥技术制备木质素酶制剂，最终获得酶活为2790.17U/kg的酶制剂，酶活回收率为83.27%。不同批次生产的酶制剂酶活无显著差异，产品较稳定。酶制剂处理后的烤烟风味显著改善，烤烟的香气量、甜感、细腻程度均有所提升。 （3）高产木质素过氧化物酶（Lip）的YY-10菌株和高产锰过氧化物酶（MnP）的BY-2菌株对烤烟品质影响的对比分析及机理研究。与菌株BY-2发酵粗酶液处理后的烤烟相比，菌株YY-10发酵粗酶液处理后的烤烟中酸不溶性木质素含量显著下降（P＜0.05），可减轻烤烟的药味和化学气息等杂气；烤烟中大马士酮、3-乙基-4-甲基吡咯-2,5-二酮、亚油酸甲酯、5-甲基呋喃醛、巨豆三烯酮C、4-羟基-二氢大马酮、6-甲基-3,5-戊二烯-2-酮等VIP值＞1的挥发性风味物质含量显著增加（P＜0.05），可提升烤烟的香气量，改善烤烟品质。通过转录组学对比发现，与BY-2菌株相比，YY-10菌株中与葡萄糖和氨基酸的跨膜转运、氨基酸代谢、遗传物质的生物合成、合成蛋白质等方面相关基因表达上调，促进了Lip的生物合成；同时与金属离子跨膜转运通路相关的copO基因和pxpG基因表达上调，利于Cu2+的转出以及Fe2+的转入和转化，促进Lip合成所需的金属离子的产生。由此说明，同为木质素降解酶，Lip在改善烤烟品质中具有更显著的作用。
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