摘要
研究背景 乳腺癌已经成为全球发病率最高的癌症，乳腺癌肺转移是乳腺癌预后不良以及死亡率增加的重要原因，但其分子机制尚未被认识清楚。斯钙素1(Stanniocalcin1,STC1)是一种参与多种生理和病理过程的糖蛋白。近年来，研究发现STC1可促进乳腺癌转移，但其作用机制仍不清楚。研究STC1在乳腺癌肺转移中的作用及机制，有利于深入了解乳腺癌转移的机理，为乳腺癌治疗提供潜在治疗靶点。 研究方法 1.通过KMplotter数据库以及GEO数据集明确STC1与乳腺癌肺转移病人生存预后的关系。 2.通过RT-qPCR及Westernblot检测STC1在乳腺癌肺转移细胞株中的表达。 3.采用慢病毒感染建立过表达和敲低STC1的乳腺癌细胞稳转株。 4.分别采用CCK8增殖实验、Transwell迁移与侵袭试验和balb/c裸鼠成瘤实验以及肺转移模型检测STC1对乳腺癌细胞增殖及转移的作用。 5.采用免疫组化检测STC1对乳腺癌肺转移肿瘤微环境的影响。 6.分别通过小管形成实验、Transwell迁移实验检测STC1对HUVECs小管形成和肺成纤维细胞MRC5迁移的影响。 7.RT-qPCR检测STC1对MRC5细胞中炎症细胞因子表达的影响。 8.通过RNA-seq、RT-qPCR、Westernblot、ChIP-qPCR、免疫组化等方法探讨STC1上下游的分子调控机理。 研究结果 1.STC1与乳腺癌肺转移有关 STC1在乳腺癌肺转移细胞中的表达量相对于其在乳腺癌细胞中的表达更高。STC1的高表达与乳腺癌病人较差的总生存期(HR=1.53,95％CI:1.21～1.94,P=0.00035)、无远处转移生存期(HR=1.35,95％CI:1.12～1.63，P=0.0016)和无肺转移生存期(HR=2.36,95％CI:1.23～4.38，P=0.0039)相关。 2.构建过表达和敲低STC1的乳腺癌细胞稳转株 利用慢病毒成功构建STC1过表达和敲低的乳腺癌细胞稳转株，分别命名为MDA-MB-231-EV、MDA-MB-231-STC1、LM2-shNC、LM2-shSTC1。 3.STC1不影响乳腺癌细胞的增殖 经重组蛋白STC1处理的乳腺癌细胞的增殖能力无明显改变(P＞0.05)。MDA-MB-231-STC1细胞与MDA-MB-231-EV细胞的增殖能力无明显差异，LM2-shSTC1细胞与LM2-shNC细胞的增殖能力也无明显差异。裸鼠成瘤试验中，MDA-MB-231-STC1细胞形成的瘤体的重量((0.41±0.17)g)与对照细胞MDA-MB-231-EV细胞形成的瘤体的重量((0.31±0.14)g)无明显差别(P＞0.05)。 4.STC1促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭 经重组蛋白STC1处理的乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力增强，差异有统计学意义(P＜0.05)。与MDA-MB-231-EV细胞相比，MDA-MB-231-STC1细胞的迁移和侵袭能力更强，差异有统计学意义(P＜0.05)。与LM2-shNC细胞相比，LM2-shSTC1细胞的迁移和侵袭能力更弱，差异有统计学意义(P＜0.05)。 5.STC1促进乳腺癌细胞的肺转移 在乳腺癌肺转移裸鼠模型中，MDA-MB-231-STC1细胞形成的肺部肿瘤结节数量(136.8±13.9)较对照细胞MDA-MB-231-EV细胞形成的肺部肿瘤结节数量(65.5±49.2)更多，差异有统计学意义(P＜0.05);LM2-shSTC1细胞形成的肺部肿瘤结节数量(33.7±14.8)较对照细胞LM2-shNC细胞形成的肺部肿瘤结节数量(70.4±22.5)更少，差异有统计学意义(P＜0.05)。 6.STC1对乳腺癌肺转移灶中基质细胞的影响 乳腺癌肺转移裸鼠模型中,MDA-MB-231-STC1组乳腺癌细胞形成的肺转移灶中CD31阳性细胞的数量和染色强度明显高于MDA-MB-231-EV组;LM2-shSTC1组乳腺癌细胞形成的肺转移灶中CD31的阳性细胞的数量和染色强度明显低于LM2-shNC组。 7.STC1对血管生成的作用 经重组蛋白STC1处理的HUVECs的管形成能力无明显改变(P＞0.05)。与经重组蛋白STC1预处理的乳腺癌细胞共培养的HUVECs的小管形成能力明显增强(P＜0.05)。共培养条件下，过表达STC1的乳腺癌细胞促进HUVECs管形成的能力增强(P＜0.05)，而敲低STC1的乳腺癌细胞促进HUVECs管形成的能力被削弱(P＜0.05)。 8.STC1对肺成纤维细胞迁移的作用 经重组蛋白STC1处理的肺成纤维细胞MRC5的迁移能力无明显改变(P＞0.05)。经重组蛋白STC1预处理的乳腺癌细胞具有更强的促进MRC5细胞迁移的能力(P＜0.05)。过表达STC1的乳腺癌细胞促进MRC5细胞迁移的能力增强(P＜0.05)，而敲低STC1的乳腺癌细胞促进MRC5细胞迁移的能力被削弱(P＜0.05)。 9.STC1对肺成纤维细胞炎症的作用 与肺转移乳腺癌细胞LM2共培养的MRC5细胞中促炎细胞因子IL1B、IL6、IL8的表达水平明显高于与MDA-MB-231细胞共培养的MRC5细胞中促炎细胞因子的表达水平(P＜0.05)。经重组蛋白STC1处理的MRC5细胞中促炎因子IL1B、IL6、IL8的表达无明显改变(P＞0.05)。与经重组蛋白STC1预处理的乳腺癌细胞共培养的MRC5细胞的促炎细胞因子表达升高（P＜0.05）。过表达STC1的乳腺癌细胞促进MRC5细胞中促炎因子表达的能力增强（P＜0.05），而敲低STC1的乳腺癌细胞促进MRC5细胞中促炎因子表达的能力被削弱（P＜0.05）。 10.肺转移乳腺癌中STC1促进S100A4的表达 转录组测序发现，相较于MDA-MB-231-EV细胞，MDA-MB-231-STC1细胞中S100A4的表达更高。RT-qPCR、Westernblot及免疫组化均证明S100A4受到STC1的正向调节。机制研究发现，STC1通过促进EGFR的磷酸化及其下游ERK信号通路进而上调S100A4的表达。 11.S100A4介导STC1的功能 敲低S100A4可逆转过表达STC1促进乳腺癌细胞侵袭的作用，并可逆转过表达STC1的乳腺癌细胞对血管内皮细胞及肺成纤维细胞的作用。 12.肺转移乳腺癌中JNK信号通路激活STC1的表达 肺转移乳腺癌细胞中JNK信号通路处于激活状态，抑制JNK信号通路可下调STC1的表达，JNK信号通路下游的关键转录因子c-Jun可以结合到STC1的启动子区域。 研究结论 1.STC1促进乳腺癌细胞肺转移。 2.STC1通过促进血管生成及成纤维细胞炎性改变影响肿瘤微环境。 3.肺转移乳腺癌细胞中存在一条STC1-pEGFR-pERK-S100A4信号轴。 4.肺转移乳腺癌细胞中激活的JNK信号通路上调STC1的表达。
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