摘要
背景: 糖尿病视网膜病变(DiabeticRetinopathy,DR)是一种常见的糖尿病(DiabetesMellitus,DM)微血管并发症，但是DR的发病原因和病理机制仍不清楚。研究发现DNA甲基化在DR的发生发展中发挥着重要的作用，且DNA甲基化可能受到遗传变异的调控。研究前期，本团队对GeneExpressionOmnibus(GEO)数据库中的2个DR的表达数据库进行了差异表达分析，得到共差异表达基因20个，其中有8个基因存在至少一个CpG岛。这8个基因分别是COL3A1、COL4A2、COL6A1、KCNB1、SFRP1、SLC25A4、STXBP1、THBS1,本研究将这8个基因作为甲基化检测的目的基因。本研究旨在揭示目的基因及其位点甲基化水平与DR的相关性;随后选出最有可能与DR相关的基因，发现在DR中调控这个基因上差异甲基化位点的甲基化数量性状位点(methylationQuantitativeTraitLoci,meQTL),探究遗传变异调控DNA甲基化在DR中的作用。 研究对象和方法: 本研究采取频数匹配的病例对照研究设计。2020年1月至12月，在深圳市慢性病防治中心下设的社区卫生服务中心就诊的患者中选择研究对象，于社区就诊的DR患者中选择病例组，无视网膜病变的DM患者中选择对照组，控制对照组在年龄、性别、病程的分布上与病例组保持一致。对研究对象进行问卷调查和静脉血采集，测定血样生化指标并提取DNA。用MethylTargetTM技术对COL3A1、COL4A2、COL6A1、KCNB1、SFRP1、SLC25A4、STXBP1、THBS1这8个基因进行甲基化检测。结合本研究基因甲基化的结果和MalaCards数据库综合评估与DR相关的差异甲基化基因，挑选出最有可能与DR相关的基因，在GenotypeTissueExpression数据库中寻找可能调控此基因的单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)位点，并进行SNP分型。 定性资料用百分比描述，用卡方检验或Fisher确切概率法比较两组差异;符合正态分布的定量资料用均值±标准差描述，用t检验或t''检验比较组间差异;不符合正态分布的定量资料用中位数(Median,M)和四分位数间距(InterquartileRange,IQR)描述，用Mann-WhitneyU检验比较组间差异。用线性回归模型分析SNP与CpG位点甲基化水平的相关性，确定meQTL。用二元logistic回归分析DR的易感SNP位点，基因型分别采用显性、隐性和加性模型的方法赋值。为确定CpG位点的甲基化水平是否为meQTL和DR之间的中间因素，在SPSS中使用macroPROCESS进行中介分析。 结果: (1)研究对象一般特征 本研究纳入了150名DR患者和150名无视网膜病变的DM患者，两组女性均为55例(占36.67％),中位年龄均约56岁，DR组和DM组的DM病程无统计学差异[M(IQR)分别为8.00(4.00，13.00)和9.00(4.50，12.50),P=0.593]。 (2)目标基因/位点的甲基化水平与DR的关联 DR组THBS1基因的甲基化水平低于DM组，其M(IQR)分别为1.86％(1.72％,2.02％)和1.95％(1.80％，2.08％),且差异有统计学意义(P=0.002)。COL3A1、COL4A2、COL6A1、KCNB1、SFRP1、SLC47A1和STXBP1基因的甲基化水平在两组间均无统计学差异（P＞0.05)。23个CpG位点的甲基化水平在两组间存在差异(P＜0.05)。这些差异甲基化位点分别位于COL4A2、KCNB1、SFRP1、SLC47A1、STXBP1和THBS1这6个基因上，其中THBS1基因上的差异甲基化位点最多(8个)，KCNB1次之(6个)，SLC47A1和STXBP1基因上均有3个差异甲基化位点，SFRP1和COL4A2基因分别有2个、1个差异甲基化位点。 (3)遗传调控THBS1的甲基化与DR的关联 由于MalaCards数据库中THBS1基因与DR的关联评分为7.31，比其他几个基因与DR的关联评分高，且本研究中THBS1为DR的差异表达基因，因此本研究选取THBS1作为目标基因，研究遗传调控THBS1甲基化与DR的关联。对THBS1上8个差异甲基化CpG位点进行meQTL分析显示，rs13329154(C＞T)、rs34973764(insC)、rs5812091(dupC)是CpG-20的cis-meQTL(P=0.0145、0.0095、0.0158)。rs11070177(C＞T)是CpG-18的cis-meQTL(P=0.0201)。rs1847663(A＞G)是CpG-19的cis-meQTL(P=0.0275)。在显性、隐性和加性模型中，rs13329154、rs34973764、rs5812091、rs11070177、rs1847663这5个meQTLs均与DR无关。为探究DNA甲基化是否作为meQTL与疾病作用的中间桥梁，将THBS1差异甲基化位点的甲基化水平作为中间因素进行中介分析，结果显示，CpG-20甲基化可能介导了rs34973764对DR的作用(B=0.0535，Boot95％CI:0.004～0.1336)。 结论: (1)与无视网膜病变的DM组相比，DR组THBS1基因的甲基化水平呈低甲基化状态，且THBS1基因上与DR相关的8个差异甲基化位点均呈低甲基化。此外，COL4A2、KCNB1、SFRP1、SLC47A1、STXBP1这五个基因上也存在与DR有关的差异甲基化位点，这些差异甲基化位点在DR中的作用有待进一步研究。 (2)在DR中，THBS1基因的低甲基化状态可能受到遗传控制作用，DNA甲基化可能作为中间因素在meQTL和DR中发挥作用。 (3)本研究揭示了DR发生的病理机制，同时也为确定DR的诊断、预后生物标志物提供参考依据。
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