摘要
研究背景:乳腺癌是全世界范围内发病率和死亡率较高的一种女性相关恶性肿瘤，鉴定影响乳腺癌恶性进展的分子靶点及挖掘新的有效治疗药物对于乳腺癌的治疗具有重要意义。铁死亡是一种被重新定义的程序性细胞死亡方式，在肿瘤抑制过程中起着关键作用。研究表明，现有药物作为铁死亡诱导剂能够使乳腺癌患者产生一定的生存获益，因此挖掘铁死亡诱导剂治疗增效的分子机制对扩大乳腺癌的治疗策略以及改善患者预后有重要意义。谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathioneperoxidase4,GPX4)是生物体内一种重要的抗氧化酶，也是铁死亡谷胱甘肽途径的关键负向调控因子，与肿瘤恶性进展以及治疗耐药密切相关。目前GPX4在乳腺癌发生发展中所发挥的生物学功能及其具体调控机制尚不清楚。研究发现选择性自噬与铁死亡存在交互网络，铁蛋白自噬、脂质自噬以及时钟蛋白自噬等选择性自噬可调控铁死亡，进而影响肿瘤进展。然而，选择性自噬是否调控GPX4的降解继而影响铁死亡尚待探究。 研究目的:本研究旨在探究GPX4在乳腺癌中的表达水平及预后价值;确定靶向GPX4对乳腺癌铁死亡诱导剂治疗的影响及潜在的临床转化价值;阐述选择性自噬调控GPX4降解的分子机制，揭示新的调控肿瘤细胞铁死亡的信号通路;判断促进GPX4的选择性自噬降解能否成为乳腺癌治疗的新策略。 研究方法:利用数据库及临床样本IHC染色确定GPX4在乳腺癌中的表达水平及其与患者预后的关系。通过检测铁死亡相关指标和乳腺癌恶性表型确定抑制GPX4能否增强乳腺癌细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。通过Westernblot、qRT-PCR、免疫共沉淀、CHX半衰期实验等阐明选择性自噬调控GPX4降解的分子机制。通过Westernblot、qRT-PCR、CCK-8、脂质ROS含量检测等实验研究GPX4-AUTAC对GPX4表达水平的影响及其抗肿瘤活性。 研究结果:1.数据库分析及IHC染色结果显示GPX4在乳腺癌中高表达并且其高表达与患者较高的临床分级以及不良预后呈正相关。2.CCK-8、qRT-PCR、亚铁离子染色、铁离子比色法结果表明抑制GPX4可以增加erastin和柳氮磺吡啶诱导的铁死亡和细胞毒性，并且铁死亡抑制剂Fer-1可以逆转上述过程;JC-1染色、平板克隆、划痕、Transwell迁移和侵袭、裸鼠皮下成瘤等实验证实抑制GPX4可加强柳氮磺吡啶下调线粒体膜电位以及抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。3.Westernblot实验结果表明自噬与GPX4蛋白表达水平呈负相关性;mcherry-GPX4/GFP-LC3共定位实验结果提示乳腺癌细胞中GPX4与LC3存在共定位;CHX半衰期实验表明自噬加快GPX4的降解效率;临床样本免疫组化和数据库分析结果表明自噬相关基因与GPX4存在负相关性;泛素化实验表明诱导自噬可以时间依赖性促进GPX4K63链泛素化。4.免疫共沉淀实验结果表明选择性自噬受体p62通过UBD结构域与GPX4相互作用;mcherry-GPX4/GFP-p62共定位实验表明GPX4与p62存在共定位;Westernblot和CHX半衰期实验证实p62可以调控GPX4的选择性自噬降解。5.去泛素化实验、GPX4与去泛素化酶的相关性分析、免疫共沉淀、Westernblot及qRT-PCR结果表明去泛素化酶MPND抑制GPX4泛素化并增强其蛋白稳定性。6.Westernblot和qRT-PCR结果表明GPX4-AUTAC可以促进GPX4通过自噬途径降解;CCK-8结果表明GPX4-AUTAC可以浓度依赖性的抑制细胞存活;脂质ROS检测和qRT-PCR结果表明GPX4-AUTAC可以上调脂质ROS以及PTGS2的mRNA表达水平;CCK-8、Transwell迁移、亚铁离子染色结果表明GPX4-AUTAC可以增强柳氮磺吡啶对乳腺癌的抑制作用。 结论:GPX4在乳腺癌中高表达并且与患者的不良预后相关。GPX4表达水平与铁死亡诱导剂敏感性呈负相关性，抑制GPX4增强乳腺癌细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。GPX4通过自噬途径降解，诱导自噬促进GPX4K63链泛素化，泛素化后的GPX4与选择性自噬受体p62的UBD结构域结合。去泛素化酶MPND下调GPX4泛素化水平并增强其蛋白稳定性。GPX4-AUTAC可以促进乳腺癌中GPX4的降解并抑制细胞增殖。
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