摘要
背景:呼吸道病毒感染，如流感病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2,SARS-CoV-2)和呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)给全世界范围内的医疗系统带来了沉重的负担，数以亿计的患者因此丧失了生命。本文将联合分析SARS-CoV-2、流感病毒、鼻病毒和RSV患者RNA测序数据库筛选共同差异表达基因。并以RSV感染为模型，探究排名第一的hub基因CMPK2在重症肺炎形成中的作用及潜在机制。 方法:(1)从GEO数据库中下载SARS-CoV-2、流感病毒、鼻病毒和RSV患者鼻黏膜RNA测序数据，应用生物信息学技术筛选共同差异表达基因，构建PPI网络获得排名第一的hub基因CMPK2。进一步对CMPK2进行功能预测和药物筛选。 (2)RSV感染肺上皮细胞(BEAS-2B)构建体外感染模型，RT-qPCR和Westernblot验证CMPK2表达在感染组和对照组中的差异表达;构建CMPK2高表达质粒，筛选稳转细胞株BEAS-2B-CMPK2,通过间接免疫荧光检测CMPK2在肺上皮细胞中的亚定位;向细胞转染siCMPK2或CMPK2质粒后检测NLRP3炎症小体表达水平，探讨CMPK2与NLRP3炎症小体的调控关系;通过RT-qPCR检测高表达以及敲低CMPK2细胞对RSV病毒载量以及先天免疫分子的影响。 (3)基于CMPK2的分子结构进行建模，应用计算机虚拟筛选从FDA批准的小分子化合物库中筛选作用于CMPK2的小分子化合物，CCK8细胞活力实验筛选小分子化合物的安全浓度，并通过RT-qPCR和Westernblot检测化合物对CMPK2表达的影响，进一步通过RT-qPCR检测化合物对NLRP3炎症小体、炎症因子的影响以及抗RSV的效果。此外，我们还构建了RSV感染小鼠以及化合物干预模型，进一步验证CMPK2化合物在体内抑制NLRP3炎症小体激活以及抗病毒效果，通过HE染色检测小鼠肺部炎症情况;RT-qPCR和间接免疫荧光鉴定肺部RSV感染情况;通过RT-qPCR检测CMPK2、NLRP3等相关基因的表达以及ELISA检测小鼠肺部炎症因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达。 结果:(1)SARS-CoV-2、流感病毒、鼻病毒和RSV患者RNA测序数据联合分析结果显示，CMPK2是排名第一的hub基因,CMPK2在呼吸道病毒感染期间表达上调，与病毒感染以及NLRP3炎症小体激活密切相关。 (2)RSV感染BEAS-2B后CMPK2的表达上调，通过敲低和过表达CMPK2来揭示了CMPK2参与激活NLRP3炎症小体从而参与细胞焦亡以及扩大炎症反应;CMPK2的上调会削弱先天免疫从而促进病毒复制。 (3)ZINC253476025、ZINC169677008、厄洛替尼和地塞米松是CMPK2的抑制剂，在体内外能够抑制RSV感染诱导的肺部炎症。ZINC253476025、ZINC169677008、厄洛替尼在体内外还能减少病毒载量。 结论:CMPK2在RSV感染后显著上调，介导了NLRP3炎症小体的激活，当炎症因子释放不受控制时，加重肺部炎症损伤。CMPK2抑制了先天免疫反应，促进了病毒的复制。我们筛选了四种作用于CMPK2的抑制剂，并通过体内体外实验证实了ZINC253476025、ZINC169677008、厄洛替尼和地塞米松能减轻RSV感染诱导的肺部炎症因子的浸润，ZINC253476025、ZINC169677008、厄洛替尼体内外能够减少RSV病毒载量。
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