摘要
研究背景: 巨噬细胞可介导机体免疫及炎症调节过程。巨噬细胞的极化为细胞受诱导因素刺激后细胞表型转换的过程，在组织的再生和内环境稳态的维持方面发挥重要作用。脂肪干细胞(adiposederivedstemcells,ADSCs)来源外泌体可介导机体炎症的调控，参与巨噬细胞极化过程。miRNA是外泌体中重要的信号分子，其中miR-590-3p作为最新发现的对炎症表达具有调控功能的信号分子，是否与巨噬细胞极化存在联系，其影响巨噬细胞极化的机制仍然不够明确。 研究目的: 本课题旨在研讨ADSCs来源外泌体介导miR-590-3p参与诱导巨噬细胞极化的过程，并通过与巨噬细胞共培养初步探索miR-590-3p诱导M2型巨噬细胞极化的相关机制。 研究方法: 1.ADSCs的获取与鉴定:解剖获取雄性大鼠腹股沟脂肪垫组织进行ADSCs提取。应用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD14、CD19、CD34、CD45的表达情况，并进行ADSCs成骨、成脂诱导实验进行鉴定。 2.ADSCs来源外泌体的提取及鉴定:应用超速离心法提取外泌体，分离提取的外泌体重悬于PBS，并储存在-80℃冰箱。使用透射电镜检测外泌体形态及大小;Nanosight粒径分析外泌体的分布、直径及数量;WesternBlot检测外泌体标志物CD9、CD63、HSP90。 3.ADSCs来源外泌体与巨噬细胞共培养的情况:BCA法对ADSCs来源外泌体进行定量，以外泌体20μg/ml的剂量加入到无外泌体血清培养的巨噬细胞，与巨噬细胞共培养30小时后，使用显微镜检测各组细胞状态。 4.检测ADSCs来源外泌体对巨噬细胞的影响:设置control组、LPS和IFN-γ刺激组、外泌体刺激组，RT-PCR实验检测各组炎症因子TNF-α、Arg-1的mRNA水平;RT-PCR实验检测外泌体刺激组和control组miR-590-3p的表达情况。 5.巨噬细胞miR-590-3p过表达及敲低实验:使用InvigentechINVIDNARNA转染试剂分别与miR-590mimics、miR-590mimicsNC、miR-590inhibitor、miR-590inhibitorNC进行配伍，转染巨噬细胞24小时后进行正常换液。RT-PCR实验检测各组转染细胞中miR-590-3p的表达水平。 6.miR-590-3p过表达及敲低对巨噬细胞极化的影响:使用InvigentechINVIDNARNA转染试剂分别与miR-590mimics、miR-590mimicsNC、miR-590inhibitor、miR-590inhibitorNC进行配伍结合，转染巨噬细胞24小时后进行正常换液，其中miR-590mimics组、miR-590mimicsNC组加入LPS(1000ng/ml)和IFN-γ(20ng/ml)诱导24小时，miR-590inhibitor组、miR-590inhibitorNC组加入IL-4(20ng/ml)诱导24小时。RT-PCR实验检测各组STAT1、TNF-α、Arg-1、NOS2的表达水平。流式细胞术检测各组巨噬细胞中CD86、CD206的表达水平。WesternBlot检测各组中STAT1、p-STAT1、INOS、Arg-1蛋白的表达水平。 7.巨噬细胞STAT1敲低实验:使用InvigentechINVIDNARNA转染试剂分别与si-STAT1、si-STAT1NC进行配伍结合，转染巨噬细胞24小时后进行正常换液。RT-PCR实验检测各组转染细胞STAT1的含量。 8.巨噬细胞STAT1敲低对巨噬细胞极化的影响:使用InvigentechINVIDNARNA转染试剂分别与si-STAT1、si-STAT1NC进行配伍结合，转染巨噬细胞24小时后进行正常换液，各组加入LPS(1000ng/ml)和IFN-γ(20ng/ml)诱导24小时。RT-PCR实验检测各组STAT1、TNF-α、Arg-1、NOS2的表达水平。流式细胞术检测各组巨噬细胞中CD86、CD206的表达水平。WesternBlot检测各组中STAT1、p-STAT1、INOS、Arg-1蛋白的表达水平。 研究结果: 1.ADSCs鉴定结果:ADSCs流式检测提示细胞高表达CD29、CD44、CD73、CD90,低表达CD14、CD19、CD34、CD45。提取的细胞成功诱导成脂肪及骨组织。 2.外泌体鉴定结果:外泌体形态呈双层膜状结构、杯状形态;外泌体平均直径大小为(82.23±21.21)nm;外泌体高表达CD9、CD63、HSP90,符合文献报道的外泌体结构特征。 3.外泌体与巨噬细胞共培养实验提示ADSCs来源外泌体干预后巨噬细胞状态良好，生长速度快。 4.RT-PCR结果显示:与control组相比，外泌体刺激组miR-590-3p及Arg-1表达水平增加，TNF-α表达水平降低。 5.RT-PCR结果显示:miR-590-3pmimics组miRNA-590-3p表达水平增加，miR-590-3pinhibitor组miRNA-590-3p表达水平降低。 6.RT-PCR结果显示miR-590-3pmimics组TNF-α、iNOS的表达水平降低，Arg-1的表达水平增加。miR-590-3pinhibitor组TNF-α、iNOS和STAT1的表达水平增加,Arg-1的表达水平降低。WesternBlot结果显示miR-590-3pmimics组TNF-α、iNOS、STAT1蛋白表达水平降低，Arg-1蛋白表达水平增加。miR-590-3pinhibitor组Arg-1蛋白表达水平降低，TNF-α、iNOS、STAT1蛋白表达水平增加。流式细胞术结果提示miR-590-3pmimics组较miR-590-3pmimicsNC组CD206表达水平增加，CD86表达水平下降。miR-590inhibitor组较miR-590inhibitorNC组CD206表达水平下降，CD86表达水平增加。 7.RT-PCR结果显示si-STAT1组STAT1表达水平降低。 8.RT-PCR提示si-STAT1组iNOS、TNF-α的表达水平降低，Arg-1的表达水平增加。WesternBlot结果显示si-STAT1组iNOS、STAT1蛋白表达水平降低，Arg-1蛋白表达水平增加。流式细胞术结果提示si-STAT1组较si-STAT1NC组CD206表达水平增加，CD86表达水平下降。 结论: 1.ADSCs来源外泌体通过介导miR-590-3p参与巨噬细胞的极化过程。 2.miR-590-3p的过表达增强M2型巨噬细胞的极化，而抑制M1型巨噬细胞的极化。 3.miR-590-3p可介导STAT1调控巨噬细胞极化。
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