摘要
目的: 上皮性卵巢癌(Epithelialovariancancer,EOC)是预后最差的妇科肿瘤。有大量研究证明，卵巢癌肿瘤减灭术后残留病灶大小和肿瘤对含铂化疗的敏感性是决定卵巢癌预后的关键因素。在初始治疗中，约20％的卵巢癌患者对铂类药物不敏感，导致治疗失败;即便是对铂类药物敏感的卵巢癌患者，经过满意的肿瘤细胞减灭术和规范的化疗后，仍会出现复发，且最终都会对铂类药物产生耐药。深入探究卵巢癌铂耐药的具体机制，对延长卵巢癌患者生存时间有重要意义。本研究团队前期通过对TCGA数据库分析发现，发生铂耐药的患者会出现着色性干皮病A组结合蛋白2基因(XerodermaPigmentosumgroupAbindingprotein2,XAB2)高表达，且在我院卵巢癌患者腹水中XAB2的高表达与患者无进展生存期(Progress-freeSurvival,PFS)和总生存期(OverallSurvival，OS)缩短显著相关。因此，本研究将进一步探索卵巢癌细胞里XAB2在卵巢癌铂耐药中的分子机制，为卵巢癌铂耐药的预测和治疗提供新的科学依据。 方法: 1.通过慢病毒转染，构建XAB2稳定敲低的卵巢癌细胞A2780-shXAB2、HEY-shXAB2和XAB2稳定过表达的卵巢癌细胞SKOV3-XAB2。通过CCK8细胞毒性实验检测上述卵巢癌细胞的增殖和对顺铂(cisplatin,DDP)的IC50。通过细胞免疫荧光检测尿嘧啶核苷类似物EU表达水平，观察A2780-shXAB2和SKOV3-XAB2的新生RNA转录的恢复情况。 2.环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和139丝氨酸磷酸化染色体组蛋白A(γH2AX)是细胞发生DNA损伤的标志结构。通过细胞免疫荧光，在顺铂作用的不同时间点，检测A2780-shXAB2和SKOV3-XAB2细胞CPD及γH2AX的产生和去除情况，并通过WB和RT-PCR检测相同时间点SKOV3-XAB2中DNA损伤修复关键因子RNAPⅡ、XPC和ERCC1的转录和表达情况。 3.通过RNA测序，检测A2780-shXAB2中相对于A2780-NC差异表达的蛋白编码基因，并筛选参与肿瘤细胞DNA损伤修复的下游基因，并通过WB和RT-PCR验证其在A2780-shXAB2及A2780-NC中的表达情况。通过对TCGA数据库进行分析，探究候选基因HMGA2和XAB2的相关性及HMGA2在卵巢癌患者肿瘤组织中的表达情况，并在顺铂作用下，通过RT-PCR检测在A2780-shXAB2中HMGA2的表达情况。 结果: 1.XAB2的高表达促进卵巢癌细胞对铂类药物耐受。 (1)成功构建XAB2敲低和过表达卵巢癌细胞系A2780-shXAB2、HEY-shXAB2、SKOV3-XAB2,在这些细胞系中观察到，与对照组相比，XAB2高表达可以促进卵巢癌细胞增殖，XAB2敲低则抑制细胞增殖。在顺铂作用48小时或72小时后，SKOV3-XAB2细胞相对于对SKOV3-NC对顺铂IC50更高(P＜0.05)，A2780-shXAB2相较A2780-NC则对顺铂IC50更低(P＜0.05),HEY-shXAB2相较HEY-NC也对顺铂IC50更低(P＜0.05)。 (2)顺铂作用下，XAB2可以促进卵巢癌细胞恢复已停滞的细胞新生RNA的转录。给予顺铂后，相较于SKOV3-NC,SKOV3-XAB2在给予顺铂及顺铂撤药后的EU的表达更高(P＜0.001)，A2780-shXAB2撤药后EU的表达则低于A2780-NC(P＜0.01)。 2.XAB2参与到了不同的卵巢癌细胞DNA损伤修复途径中。 (1)XAB2促进顺铂作用下卵巢癌细胞核苷酸切除修复途径的DNA损伤修复。在顺铂作用时和撤药后，免疫荧光检测SKOV3-XAB2CPD的表达均低于对照组(P＜0.01)，A2780-shXAB2CPD的表达则高于对照组(P＜0.05)。WB和RT-PCR证实，细胞转录偶联的核苷酸切除修复(transcription-couplednucleotideexcisionrepair,TCR)途径关键因子RNAPⅡ、ERCC1在SKOV3-XAB2中高表达，全局基因修复(globalgenomerepair,GGR)途径关键因子XPC则没有显著差异。 (2)XAB2促进修复顺铂作用下卵巢癌细胞HR途径的DNA损伤修复。在顺铂作用时和撤药后，免疫荧光检测SKOV3-XAB2γH2AX的表达均低于对照组(P＜0.01)，A2780-shXAB2γH2AX的表达则高于对照组(P＜0.05)。 3.XAB2可能通过调控HMGA2参与卵巢癌细胞同源重组修复 (1)RNA测序结果显示，HMGA2是潜在的受到XAB2调控的蛋白编码基因，在A2780-shXAB2中，RT-PCR及WB验证，相较于对照组，HMGA2的蛋白表达和mRNA表达均下调。 (2)通过对TCGA数据库中的卵巢癌患者分析发现，与卵巢癌患者正常卵巢组织相比较，HMGA2在卵巢癌肿瘤组织中高表达(P＜0.05)，并与XAB2的表达水平呈正相关(P=0.002)。 结论: 1.XAB2通过核苷酸切除修复途径、同源重组途径促进铂类药物作用下卵巢癌细胞DNA损伤的修复。 2.XAB2潜在调控分子HMGA2与XAB2的表达呈正相关，XAB2的敲低抑制了HMGA2及后者靶向的DNA损伤修复识别关键因子PARP1的表达。
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