摘要
研究背景和目的: 目前，针对黑素瘤的治疗手段主要包括外科手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗。尽管各种治疗方案不断精准优化，我国晚期黑素瘤患者的5年生存率仍然不足5％。因此，黑素瘤的治疗仍然是全球医学领域研究的热点和难点。外科手术是根治早期黑素瘤的主要方法，但由于缺乏有效的治疗药物，晚期黑素瘤患者的生存状况往往不佳。靶向治疗虽然初始应答率高，患者的生存期得到明显改善，但也具有应答期平均长度短和复发率高的缺陷。免疫检查点抑制剂开启了黑素瘤治疗的全新时代，但仅有少数患者从中获益，且存在较多的免疫相关不良反应。因此，探索高效的黑素瘤治疗靶点，并结合免疫治疗和靶向治疗方案来提高治疗响应率和降低复发率是目前治疗黑素瘤的热门策略。c-Jun是转录因子复合物激活蛋白-1(Activatorprotein-1,AP-1)的重要组成部分，在黑素瘤中呈现异常高表达，被认为是治疗黑素瘤的重要靶点。然而，目前尚无被批准用于临床的有效c-Jun抑制剂。近年来，中药单体被认为是新型抗肿瘤药物的重要来源，集结构多样性、生物相容性、药理活性明确、毒副作用较小和多靶点等优势于一身。现阶段，中药单体的研究日益深入，已成为我国创新药物研究的重要途径之一，相关新药开发的速度也在不断提高。 本研究旨在筛选能靶向抑制c-Jun的中药单体，并探究其与程序性死亡受体-配体1(Programmeddeath-ligand1，PD-L1)单抗联用的效果，进而阐明相关分子机制，为黑素瘤临床治疗提供新思路。 研究方法: 1、采用分子对接和定量构效关系(QuantitativeStructure-ActivityRelationship,QSAR)模型的组合筛选策略，从1616个中药单体中筛选c-Jun靶向抑制剂; 2、通过细胞增殖与毒性实验、划痕、Transwell实验检测臭椿酮对黑素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响; 3、构建C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型，评价臭椿酮治疗黑素瘤的疗效; 4、应用Pulldown实验验证臭椿酮与c-Jun的结合效果; 5、采用Westernblot和蛋白半衰期实验检测臭椿酮对c-Jun蛋白水平的影响; 6、构建C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型评价臭椿酮联合PD-L1单抗治疗黑素瘤的疗效; 7、基于多色流式细胞术研究肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)中各免疫细胞群的改变; 8、采用Westernblot、RT-PCR和ELISA实验探究臭椿酮对PD-L1的影响; 9、运用荧光素酶报告基因实验和及染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)实验揭示c-Jun对PD-L1的转录调控作用; 10、利用CD4+T细胞体外分化实验研究臭椿酮对调节性T细胞(RegulatoryTcells,Tregs)分化的影响。 结果: 1、分子对接结合QSAR集成模型逐层筛选出臭椿酮是一种潜在的c-Jun抑制剂; 2、臭椿酮的首要潜在靶点是c-Jun; 3、臭椿酮能显著抑制黑素瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制黑素瘤小鼠移植瘤模型中的肿瘤生长; 4、臭椿酮能与c-Jun相互作用并促进其降解; 5、臭椿酮通过减少肿瘤微环境中Tregs浸润，增强PD-L1单抗对黑素瘤的疗效; 6、臭椿酮能显著抑制PD-L1的表达和分泌; 7、臭椿酮通过c-Jun调控PD-L1的转录; 8、臭椿酮通过靶向c-Jun/PD-L1信号通路抑制Tregs的分化。 结论: 中药单体臭椿酮是一种新型c-Jun抑制剂，能与c-Jun相互作用进而促进其降解，并在体内外抑制黑素瘤进展;同时，臭椿酮能靶向c-Jun/PD-L1信号通路，抑制肿瘤微环境中Tregs分化，从而增强PD-L1单抗的疗效。本研究首次发现能通过靶向c-Jun抑制黑素瘤进展的中药单体，为突破这一潜在治疗靶点的临床药物开发瓶颈提供了坚实的科学依据，也为PD-L1单抗的临床联合治疗提供新的研究方向。
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