摘要
由多重耐药细菌引起的顽固性感染，是全球公共卫生安全都面临着的严峻挑战。通过理解人类宿主中定殖进化的演变细节以及背后的选择压力，可以阐明致病的分子机制，对追踪细菌传播网络至关重要。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)呼吸道样本中分离到的最常见致病菌。由于需要长期频繁使用抗生素对抗感染，很容易从COPD呼吸道滋生多重耐药的铜绿假单胞菌。目前关注铜绿假单胞菌COPD内适应性进化的研究屈指可数，铜绿假单胞菌是否会通过适应性进化产生有利于种群持久性定殖于 COPD 呼吸道环境的普适性突变还尚未可知。 本研究从成都大学附属医院招募了15位COPD病人，每隔约两周采集病人呼吸道样本并从中分离铜绿假单胞菌，累计分离到铜绿假单胞菌209株。为对分离菌株适应情况进行整体评估，本论文首先通过横向普查了临床铜绿假单胞菌的表型、耐药性以及群体感应系统(Quorum sensing，QS)完整性等特征，结果表明抗生素耐药性与铜绿假单胞菌的多个表型具有或正或负的相关性，提示表型进化与耐药发展可能具有协同发展的趋势。在此基础上，为把握适应性定殖动态变化过程，本研究以多次取样的 L，W， C， M 四位病人来源的铜绿假单胞菌作为主要研究对象，将铜绿假单胞菌在 COPD 呼吸道的进化过程剖析为四个水平的演变： 第一是表型水平。为了表征铜绿假单胞菌在定殖过程中各毒力演化从量变到质变的过程，本论文对绿脓菌素、胞外蛋白酶外泌情况、运动能力等铜绿假单胞菌的特征表型进行了纵向比较，发现半数以上的临床铜绿假单胞菌发生了包括胞外蛋白酶在内的各种毒力因子的表达下调或功能缺失。 第二是基因水平。为了获取临床铜绿假单胞菌的基因组结构信息和适应性定殖中的高频突变基因列表，本研究对表型鉴定后筛选到的代表菌株进行了全基因组测序，利用单核苷酸多态性和多位点序列分型构建了系统发育树，绘制了定殖于 W 病人呼吸道的铜绿假单胞菌亚群的多线程平行进化轨迹，并为医院内铜绿假单胞菌的病人间交叉传播现象提供了证据。 第三是转录水平。为了解决表型与基因型演化结合不紧密的问题，通过转录组测序比较分析得到了进化株对比初始分离株的差异表达基因富集KEGG通路和GO的功能类别。本研究发现铜绿假单胞菌QS系统功能下调或缺失事件在持续性定殖过程中频繁发生，并且QS完整和QS缺陷的铜绿假单胞菌多亚群共定殖于COPD的情况更为常见。 第四是种群水平。为了比较铜绿假单胞菌QS完整与QS缺陷株的持续性定殖能力的差异，探究定殖时两者对宿主造成的影响，本研究通过秀丽隐杆线虫和小鼠两种动物模型模拟临床QS完整株与缺陷株分别定殖、共同定殖时的种群数量以及比例变化，证明了相较于完整株QS缺陷株在持续性定殖过程中可能具有独特的优势。 总而言之，本研究主要完成了一项对临床铜绿假单胞菌横向普查与长期追踪监测工作，通过表型、基因组转录组测序以及动物模型，成功补全了目前文献缺少的COPD背景下的铜绿假单胞菌的毒力情况和转录景观的空缺，动态剖析了一条铜绿假单胞菌多样亚群结构形成的途径，解析了铜绿假单胞菌亚群结构变化对宿主带来的影响，为铜绿假单胞菌与 COPD急性加重的相关性提供了解释，纵向加深了学界对 COPD呼吸道感染反复恶化发作生物学过程和分子机理的科学认识。
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