摘要
背景:结直肠癌(ColorectalCancer，CRC)是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病率和死亡率都非常高。目前针对结直肠癌的根治性治疗方式是手术切除，对于晚期和转移性结直肠癌患者，通常会给予药物辅助治疗以改善手术效果和预防肿瘤复发。在结直肠癌诊疗指南中，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是临床医师首推的一线药物，能够有效地抑制肿瘤细胞生长，预防肿瘤复发和转移，改善患者预后。但由于患者易对5-FU产生先天性或获得性耐药，其治疗的有效性会受到严重影响。因此，本研究首先基于生物信息学策略筛选出一批包括Discoidin、CUB和LCCL结构域2编码基因(Discoidin,CUBandLCCLDomain-containing2,DCBLD2)在内的与5-FU耐药及患者预后不良相关的潜在靶点基因。既往研究已报道DCBLD2基因在多种肿瘤中高表达，且与患者预后不良相关，可能是一个潜在的恶性肿瘤治疗靶点。但目前关于该基因在恶性肿瘤中的作用机制及其对化疗药物敏感性的影响仍是未知的，探讨该基因影响结直肠癌进展以及5-FU药物敏感性的调控机制，能够为结直肠癌的临床治疗提供新的分子标志物，有益于提高药物疗效，改善患者预后。 目的:研究DCBLD2基因对结直肠癌5-FU耐药的作用及机制，并在泛癌层面进一步探讨其对肿瘤恶性程度及药物疗效的影响。 方法:通过生物信息学策略筛选结直肠癌中5-FU耐药的潜在基因靶点，将其中的DCBLD2基因作为后续研究对象。通过查询GEO和TCGA数据库，对比肿瘤组织和正常组织中DCBLD2的表达差异性及其对预后的影响，利用已有临床样本对数据库分析结果进行验证。利用GDSC数据库进行数据分析，研究DCBLD2的表达差异对肿瘤细胞5-FU药物敏感性的影响。通过CCK-8、EdU和克隆形成实验分析DCBLD2对结直肠癌细胞HCT116和CACO-2增殖能力和5-FU药物敏感性的影响，通过裸鼠成瘤实验验证以上结果。利用HUVEC细胞进行血管生成实验和基质胶塞实验，研究DCBLD2对血管新生能力的影响。通过q-PCR、WesternBlot、Transwell侵袭和迁移实验研究DCBLD2基因对上皮-间质转化(Epithelial-MesenchymalTransformation,EMT)信号通路的影响。通过TAP-MS实验寻找与DCBLD2蛋白结合的下游靶蛋白并通过Co-IP实验验证，通过细胞粘附实验、q-PCR和WesternBlot实验分析DCBLD2对ITGB1/FAK/AKT通路的调控作用。此外，我们还利用多个在线数据库在泛癌层面对DCBLD2进行了基因表达差异分析、预后价值分析、免疫表型评分分析、药物敏感性分析以及下游信号通路的富集分析。 结果:通过生物信息学分析，筛选得到了16个可能与5-FU药物敏感性和结直肠癌患者生存期相关的潜在基因。数据库和临床样本分析的结果表明，DCBLD2在结直肠癌组织中的表达要高于正常组织，且导致患者预后不良。GDSC数据库的分析结果表明DCBLD2基因的高表达导致肿瘤细胞对5-FU耐药。CCK-8、EdU和克隆形成实验结果表明DCBLD2基因受到抑制后，结直肠癌细胞的增殖能力减弱，对5-FU的药物敏感性增强，裸鼠成瘤实验结果验证了以上结论。血管生成和基质胶塞实验结果表明DCBLD2基因受到抑制后，血管新生的能力减弱。q-PCR、WesternBlot、Transwell侵袭和迁移实验结果表明下调DCBLD2基因抑制EMT的通路活性，并由此调控5-FU的药物敏感性。TAP-MS实验寻找到与DCBLD2蛋白结合的下游靶蛋白ITGB1,通过Co-IP实验验证了以上结果，细胞粘附实验、q-PCR和WesternBlot实验结果证明DCBLD2对ITGB1/FAK/AKT通路具有调控作用。此外，泛癌生物信息学分析结果也表明在绝大部分癌症中DCBLD2表达水平与患者预后不良、免疫抑制和药物敏感性降低呈现正相关关系。 结论:DCBLD2通过影响细胞增殖、迁移、侵袭和血管新生而影响结直肠癌的发生发展。DCBLD2通过影响EMT和血管新生来调控结直肠癌患者对5-FU的敏感性。泛癌层面的研究提示DCBLD2可能是一个导致预后不良的、与免疫调控和药物敏感性相关的潜在生物标志物。
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