摘要
目的:探讨人脐带间充质干细胞(Humanubilicalcordmesenchymalstemcells,hUC-MSCs)外泌体及介导LncRNA对退变髓核细胞(Nucleuspulposuscells，NPCs)的影响。通过高通量基因测序，我们筛选出与NPCs退变相关的基因LncRNAMEG3，并通过将LncRNAMEG3基因过表达，进一步探索目的基因在NPCs退变过程中的作用机制。 方法:实验采用酶消化法从退变髓核组织中提取出NPCs,通过甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色对细胞进行染色鉴定。PKH26染色实验证明外泌体的跨膜能力，运用CCK-8、qRT-PCR、流式细胞术验证hUC-MSCs外泌体对NPCs的细胞增殖、炎症反应、以及对细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)的合成和降解的影响。之后对外泌体干预组和外泌体阴性组的细胞进行高通量基因测序，根据FoldChange≥2作为差异性筛选标准筛选LncRNA和mRNA,通过基因本体论(GeneOntology，GO)和京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)对差异表达基因的生物学功能进行富集分析，并进一步筛选出差异表达的目的基因LncRNAMEG3,为探索其作用机制，通过转染质粒载体，将NPCs中LncRNAMEG3过表达，使用qRT-PCR、流式细胞术等进一步评估细胞的凋亡、炎症反应及ECM的合成降解。 结果:本研究提取的NPCs形态不规则，呈梭形或多角形，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色阳性，说明细胞能够分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原，PKH26外泌体染色及CCK-8实验结果提示hUC-MSCs外泌体能够被NPCs摄取且能促进其增殖，qRT-PCR结果显示，在外泌体干预后，与外泌体阴性组相比，NPCs与炎症反应、ECM降解、细胞凋亡有关的基因IL-1β、ADAMTS-4、MMP-13、caspase-3等表达均明显下降，说明hUC-MSCs外泌体可以减少NPCs炎症因子的分泌，抑制ECM的降解，并能够延缓细胞凋亡。通过芯片分析，我们检测到9877个差异表达的LncRNA和1224个差异表达的mRNA,根据FoldChange≥2标准进行筛选，与对照组相比，外泌体干预组分别有826个显著上调及832个显著下调的LncRNA,84个显著上调和87个显著下调的mRNA，使用芯片中的上调的差异基因进行GO分析。在细胞成分和分子功能条目中，Extracellularmatrix、Caspasebinding等条目被显富集，使用芯片中的下调的差异基因进行GO分析，在生物过程条目中，Regulationofinflammatoryresponse、Acuteinflammatoryresponse等条目被显著富集，表明外泌体处理后的髓核细胞其炎症反应、细胞凋亡、ECM相关基因受到了较大的影响。在筛选出所需的目的基因LncRNAMEG3后，通过质粒转染的方式将其在NPCs中过表达，并运用qRT-PCR、流式细胞术进一步验证，结果表明，在将目的基因过表达后，细胞的凋亡水平，炎症反应以及ECM的降解显著降低。 结论: 1、在IDD中，hUC-MSCs外泌体能够被NPCs摄取，且能够促进NPCs的增殖、抑制NPCs凋亡、减少细胞炎症反应，并能抑制ECM的降解。 2、基因芯片的结果表明，在hUC-MSCs外泌体对退变NPCs的影响上，其介导的LncRNA发挥了重要的作用。 3、LncRNAMEG3过表达实验证明，hUC-MSCs外泌体介导的LncRNAMEG3对退变NPCs的作用可能是在炎症、凋亡、ECM降解等方面的影响。
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