摘要
背景和目的:脑出血(IntracerebralHemorrhage,ICH)是由脑血管破裂和血液进入脑实质引起的严重疾病，是最致命和最难治疗的卒中亚类。然而，目前没有药物经美国食品和药物管理局批准可用于治疗ICH。因此，迫切需要探索新的治疗手段来减轻ICH后的脑损伤。中医基于整体观的辨证论治体系，在早期干预、综合治疗和个性化诊疗疗方面显示出优势。ICH属于中医“中风”范畴，以气虚血瘀为病机，以益气活血为主要治则。补阳还五汤(BuyangHuanwuDecoction,BYHWD)是益气活血法的代表方，在治疗ICH中疗效显著。因此，探究BYHWD对ICH后的作用机制十分必要。本研究拟通过动物实验和细胞实验，采用转录组学结合分子生物学技术，从microRNA(miRNA)的角度探讨BYHWD治疗ICH的作用机制，为BYHWD治疗ICH提供新的理论依据。 方法:第一部分:对BYHWD治疗ICH小鼠的疗效评估。BC57BL/6J小鼠随机分为5组:假手术组、ICH组、BYHWD低、中、高剂量组。通过胶原酶Ⅶ诱导构建ICH小鼠模型，药物干预14天后，采用改良神经功能评分、错足实验、水迷宫实验、体重变化评估BYHWD对神经功能的改善。借助HE染色、尼氏染色、IgG染色、劳克坚牢蓝染色评估BYHWD对ICH小鼠脑组织损伤的改善程度。通过血常规、凝血功能、肝肾功能以及主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)的HE染色，确定BYHWD对ICH小鼠有无毒副作用。借助透射电子显微镜确定BYHWD对ICH小鼠髓鞘结构的影响。髓鞘蛋白脂质蛋白(Myelinproteolipidprotein，PLP)和髓磷脂碱性蛋白(Myelinbasicprotein,MBP)是少突胶质细胞(Oligodendrocytes，OLs)髓鞘的主要标志物。Oligodendrocytetranscriptionfactor2(Olig2)/adenomatouspolyposiscolicloneCC1(CC1)是成熟OLs的标志物，plateletderivedgrowthfactorreceptoralpha(PDGFRα)是少突胶质细胞前体细胞的主要标志物。采用qRT-PCR检测MBP、PLP，免疫荧光检测MBP/TAU、Olig2/CC1、PDGFRα/proliferatingcellnuclearantigen(PCNA)以明确BYHWD对ICH小鼠OLs分化和髓鞘修复的影响，并通过体外实验进行验证。第二部分:运用转录组学探究BYHWD对ICH小鼠髓鞘的修复作用。应用小鼠脑组织转录组学和疾病数据库联合分析筛选BYHWD调控的差异基因，并通过体内、体外实验进行验证。接着，我们使用G蛋白偶联受体17(G-proteincoupledreceptor17,GPR17)抑制剂—普仑司特(Pranlukast)作为阳性对照，借助ICH小鼠模型探究BYHWD是否发挥了类似pranlukast的作用机制。第三部分:通过miRNA测序探究BYHWD调控关键mRNA的上游机制。我们通过miRNA测序获取BYHWD治疗ICH小鼠脑组织的miRNA谱，并结合miRNA数据库预测筛选潜在的差异miRNAs。结合体内、体外实验使用qRT-PCR验证差异miRNAs表达，利用RNA原位杂交技术确定此miRNA-mRNA是否在细胞质中共定位。最后，对目标miRNA通过血红素细胞模型进行miRNA-mRNA的作用机制探究。借助双萤光素酶报告基因实验确定其是否直接结合，应用miRNAmimic和inhibitor通过qRT-PCR和免疫荧光评估其对OLs分化和髓鞘形成的影响。 结果:第一部分:BYHWD对ICH小鼠具有神经保护作用，通过促进OL分化和成熟以改善ICH后髓鞘修复。BYHWD有效改善了ICH小鼠的神经功能(改良神经功能评分、错足实验、水迷宫和体重改变)，且其疗效呈浓度依赖性。形态学染色结果显示BYHWD显著减少了ICH小鼠损伤区脑组织神经细胞死亡、炎症浸润和血脑屏障破坏并促进了髓鞘修复。综合血常规、凝血功能、肝肾功能检测和主要脏器HE染色，结果表明BYHWD未引起明显的毒副作用。qRT-PCR和免疫荧光实验揭示了BYHWD通过促进OLs分化而非增殖加快再髓鞘化进程。第二部分:BYHWD发挥类似Pranlukast的作用，通过下调GPR17的水平，促进OL分化和髓鞘修复，并改善ICH小鼠的神经功能。转录组学联合疾病数据库分析显示BYHWD改善ICH后髓鞘修复与GPR17密切相关。动物实验证实BYHWD发挥类似GPR17抑制剂pranlukast的作用，调控GPR17以促进ICH小鼠的OLs分化和髓鞘修复，并改善神经功能缺损。第三部分:BYHWD通过miR-760-3p/GPR17促进ICH后髓鞘修复。miRNA测序联合miRNA数据库预测筛选了靶向GPR17的差异miRNAs。其中，4个数据库均预测到miR-760-3p对GPR17的结合作用。通过体内、体外实验验证了BYHWD增加miR-760-3p的表达。RNA原位杂交实验显示miR-760-3p可以与GPR17有效共定位。双萤光素酶报告基因实验显示miR-760-3p与GPR17直接结合。应用miR-760-3pmimic和inhibitor,我们发现BYHWD通过增加miR-760-3p抑制GPR17的表达，并改善OLs的再髓鞘化。 结论:本研究证实了BYHWD通过miR-760-3p/GPR17轴促进ICH后OLs分化和髓鞘修复，从而发挥脑保护作用。本研究为BYHWD治疗ICH的生物学基础提供了新的证据，为开发具有脑保护作用的创新中药提供了新思路。
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