摘要
目的： 探讨通络益肾方通过调控系膜细胞（GMCs）源外泌体miRNA的表达抑制足细胞焦亡，减轻肾脏炎症反应，延缓糖尿病肾病进展。为中医药防治糖尿病肾病提供理论依据。 方法: 1. 5.6mM葡萄糖浓度培养的肾小球系膜细胞设为正常糖组(NG组)，30mM葡萄糖浓度设为高糖组（HG组），培养24小时，收集细胞上清液，超速离心法提取外泌体，透射电镜鉴定外泌体形态及大小，Western Blot检测外泌体标志蛋白HSP70、CD81的表达。 2. 高糖诱导系膜细胞来源外泌体处理足细胞建立模型。课题组前期通过高通量测序筛选出具有差异性的miRNA，即表达上调的miR-192-5p。利用外泌体分泌抑制剂GW4869， miRNA inhibitor干预技术及通络益肾方干预系膜细胞，系膜细胞分组为正常组（NG组）、高糖组（HG组）、外泌体抑制剂组（GW4869组）、miR-192-5p抑制剂组 （miR-192-5p-inhibitor组）、通络益肾方组（TLYSF组），提取各组的外泌体与足细胞共培养，分组为外泌体空白组（NO-Exo）、外泌体正常糖组（正常糖处理的GMCs源外泌体孵育的足细胞，NG-GMCs-Exo）、外泌体高糖组（HG-GMCs-Exo）、外泌体抑制剂组（GW4869+HG-GMCs-Exo）、外泌体通络益肾方组（TLYSF+HG-GMCs-Exo），外泌体miR-192-5p-inhibitor组（miR-192-5p-inhibitor+HG-GMCs-Exo）。置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，收集细胞进行检测。 3. 足细胞黏附实验检测细胞黏附能力，透射电镜观察足细胞超微结构及焦亡情况，Real-time PCR检测足细胞焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA的表达，免疫荧光检测NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β蛋白的表达。Western Blot检测足细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC的表达。 结果： 1. 透射电镜结果显示：电镜下观察到外泌体为杯口状，直径在30-100 nm，与文献中描述相同。Western Blot 检测结果显示 HSP70和 CD81在外泌体中有表达，内质网分子伴侣Calnexin不表达，以上可知从上清液提取出的为不含细胞成分的外泌体。 2. 黏附实验结果显示：与NG-GMCs-Exo相比，HG-GMCs-Exo足细胞黏附能力明显降低（plt;0.01），与HG-GMCs-Exo相比，GW4869+HG-GMCs-Exo、miR-192-5 p-inhibitor+HG-GMCs-Exo及TLYSF+HG-GMCs-Exo黏附能力均不同程度提高（plt;0. 01）。 3. 大鼠足细胞透射电镜结果显示：NG-GMCs-Exo足细胞形态结构正常，细胞核形态正常，染色质分布均匀，核膜清晰完整，细胞膜完整连续。HG-GMCs-Exo足细胞细胞发生焦亡，细胞胀大至细胞膜破裂，细胞核不规则，核仁明显，线粒体轻度固缩，膜电子密度增高，嵴变粗减少；粗面内质网扩张。GW4869+HG-GMCs-Exo，amp;nbsp;TLYSF+HG-GMCs-Exo及miR-192-5p-inhibitor+HG-GMCs-Exo足细胞损伤情况较H G-GMCs-Exo减轻。 4. Real-time PCR结果显示：与NG-GMCs-Exo相比，HG-GMCs-Exo足细胞N LRP3、Caspase-1、ASCmRNA表达显著升高（plt;0.01），与HG-GMCs-Exo相比，G W4869+HG-GMCs-Exo，miR-192-5p-inhibitor+HG-GMCs-Exo及TLYSF+HG-GMCs-Exo足细胞NLRP3、Caspase-1、ASCmRNA表达均不同程度降低（plt;0.01）。 5. 免疫荧光结果显示：与NG-GMCs-Exo相比，HG-GMCs-Exo足细胞NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β荧光强度显著增强，NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β主要表达于细胞浆内，与HG-GMCs-Exo相比，GW4869+HG-GMCs-Exo，miR-192-5p-inhi bitor+HG-GMCs-Exo及TLYSF+HG-GMCs-Exo足细胞NLRP3、Caspase-1、ASC、I L-1β荧光强度均不同程度减弱。 6. Westrrn Blot检测结果显示：与NG-GMCs-Exo相比，HG-GMCs-Exo足细胞NLRP3、Caspase-1、ASC表达显著升高（plt;0.01），与HG-GMCs-Exo相比，GW48 69+HG-GMCs-Exo，miR-192-5p-inhibitor+HG-GMCs-Exo及TLYSF+HG-GMCs-Exo足细胞NLRP3、Caspase-1、ASC表达均不同程度降低（p＜0.05或plt;0.01）。 结论： 高糖诱导系膜细胞（GMCs）源外泌体miR-192-5p导致足细胞焦亡；通络益肾方调控系膜细胞源外泌体miR-192-5p表达保护足细胞，通过下调NLRP3、Caspase-1、ASC表达，减少细胞焦亡。
NETL