摘要
目的：研究小建中汤能否通过P62/KEAP1/NRF2信号通路抑制胃黏膜上皮细胞氧化应激与铁死亡，从而抑制4-HNE、MDA等脂质过氧化物与炎症因子IL-6、TNF-α的表达，激活抗氧化靶基因SLC7A11、GPX4和HO-1的表达发挥保护或修复胃黏膜的作用。进一步探索和丰富小建中汤治疗胃黏膜损伤的具体内在的分子机制。以期为小建中汤治疗胃黏膜损伤提供更为具体的内在分子机制和较为科学的数据支撑。 方法： 1.造模及给药方法：C57BL/6小鼠60只（雄性，5周龄，17g?21g）作为实验对象，统一饲养于明暗交替的陕西中医药大学基础医学院动物房内。小鼠适应性饲养1周，随机分为空白组（Control）、模型组（Model）、小建中汤高剂量组（XJZ H）、小建中汤中剂量组（XJZM）、小建中低剂量组（XJZL）与奥美拉唑组（OME）。模型组、小建中各治疗组以及阳性对照组均采用阿司匹林复制胃黏膜损伤模型。模型组早晨给与阿司匹林（300mg/kg）灌胃；小建中汤三个不同浓度组早晨给与阿司匹林（300mg/kg）灌胃，下午分别予以小建中汤灌胃，高剂量组12g/kg，中剂量组6g/kg，低剂量组3g/kg灌胃治疗。奥美拉唑组早晨灌胃阿司匹林（300mg/kg），下午灌胃奥美拉唑（20mg/kg），共14d。 2.实验方法：模型复制成功后，小鼠禁食12h。戊巴比妥钠麻醉后眼球采血，提取血清备用。摘取小鼠胃组织，沿胃大湾剪开，切除胃窦与胃体交界部分，其余部分胃组织放于包埋框内，4%多聚甲醛溶液固定，部分组织放于EP管内置于-80℃冰箱保存备用。制作病理切片，通过HE染色观察小鼠胃黏膜组织的病理改变；酶联免疫吸附法（ELSIA）检测小鼠胃黏膜组织中炎症因子IL-6、TNF-α的表达；免疫组化（IHC）检测小鼠胃黏膜组织铁死亡的标志物4-HNE与巨噬细胞标志物F4/80的含量，以及抑制铁死亡的关键酶GSH的表达；免疫荧光（IF）检测抗氧化靶基因HO-1的表达；Western Blot检测抗氧化信号通路P62/KEAP1/NRF2的蛋白表达；RT-PCR法检测小鼠胃组织中P62、KEAP1、NRF2等mRNA的水平。 结果： 1.小建中汤对小鼠一般情况的影响 空白组小鼠精神及营养状态良好、运动自如、毛发旺盛、食纳正常、大便成形。与空白组比较，模型组小鼠精神状态萎靡、眯眼蜷缩、运动减少、食纳减少、毛发失泽。小建中汤不同浓度治疗组与阳性药物组小鼠相较于模型组而言各项症状均有不同程度减轻，其中以小建中汤高剂量组改善最为明显。 2.小建中汤对阿司匹林诱导的胃黏膜损伤小鼠的体重影响 与空白组相比，模型组小鼠体重下降明显（Plt;0.0001）；与小建中高剂量组相比，模型组小鼠体重显著改善呈上升趋势（Plt;0.001），与小建中中剂量组相比（Plt;0.01），与小建中低剂量组相比无显著差异性；与阳性对照组相比治疗效果与小建中高剂量组一致（Plt;0.001）。 3.小建中汤对阿司匹林诱导的胃黏膜损伤小鼠胃组织炎症因子的影响 与空白组相比较，阿司匹林诱导的模型组小鼠炎症标志物IL-6、TNF-α、F4/80的表达显著升高，且模型组小鼠胃黏膜组织腺体分布散乱；与模型组相比较，小建中三个浓度梯度治疗组炎症因子的表达明显降低，其中以高剂量组为最佳，且胃黏膜腺体分布较前改善。 4.小建中汤对阿司匹林诱导的胃黏膜损伤小鼠病理学状态影响 与空白组比较，模型组小鼠胃黏膜腺体排列结构紊乱，有较为明显的黏膜出血和糜烂。胃黏膜上皮可见明显的黄染炎症因子分布较多；相较于模型组各治疗组与阳性药物组，黏膜腺体排列较为整齐，腺体完整，黏膜糜烂出血症状改善，黄染面积减小，炎症因子减少，以小建中汤高剂量组改善最为明显。 5.小建中汤对阿司匹林诱导的胃黏膜损伤小鼠ZO-1蛋白的影响 相较于空白组，模型组小鼠胃黏膜组织ZO-1的表达呈下降趋势（Plt;0.001），与模型组相比，小建中汤干预后，阿司匹林诱导的小鼠胃黏膜组织ZO-1蛋白含量增加（Plt;0.01），且广泛分布于胃黏膜上皮，其中以小建中汤高剂量效果最为明显。奥美拉唑组小鼠的蛋白表达也呈增加趋势（Plt;0.001）。 6.小建中汤对阿司匹林诱导的胃黏膜损伤小鼠胃黏膜上皮氧化应激的影响 我们用IHC检测了小鼠胃黏膜上皮细胞的4-HNE的表达，从结果可知，与空白组相比，模型组小鼠胃黏膜上皮4-HNE广泛分布，且数量增多（Plt;0.01），伴有黏膜上皮的排列紊乱和腺体肿大；与小建中汤治疗组相比，4-HNE的蛋白表达显著得到抑制，黏膜上皮排列恢复整齐，水肿改善（Plt;0.05）。奥美拉唑组的表达也呈现上升趋势（Plt;0.05）。 WB检测了抗氧化基因SLC7A11与GPX4的表达，从结果可知，相较于空白组而言，模型组中蛋白的表达均被抑制（Plt;0.01），在经过小建中汤干预后蛋白表达被激活呈上升趋势（Plt;0.05）；奥美拉唑组的表达也呈现上升趋势（Plt;0.05）。 7.小建中汤对P62/KEAP1/NRF2信号通路的影响 与空白组相比，P62的蛋白表达在模型组中显著降低（Plt;0.001），经过小建中汤干预后，P62的表达逐渐升高，尤以小建中高剂量组最佳（Plt;0.001）；与空白组相比，模型组中NRF2的蛋白表达也显著被抑制（Plt;0.001），在小建中各剂量组干预后逆转了这种趋势（Plt;0.01）；与空白组相比，KEAP1的表达在模型组表现为升高趋势（Plt;0.01），经过小建中汤治疗之后，表达降低（Plt;0.05）。 结论： 1.小建中汤能改善阿司匹林诱导的小鼠胃黏膜组织病理状况。 2.小建中汤能改善阿司匹林诱导的胃黏膜损伤小鼠体重下降情况。 3.小建中汤能显著抑制阿司匹林诱导的小鼠胃黏膜组织中炎症因子的浸润，降低炎症因子IL-6、TNF-α、F4/80的表达。 4.小建中汤能显著改善阿司匹林诱导的小鼠胃黏膜上皮屏障损伤，维持胃黏膜的完整性。 5.小建中汤能显著抑制阿司匹林诱导的小鼠胃黏膜组织上皮细胞的氧化应激，降低有毒性醛4-HNE的表达升高，抗氧化相关基因SLC7A11和GPX4的表达。减少氧化应激对胃黏膜上皮细胞的损伤。 6.小建中汤能显著抑制阿司匹林诱导的小鼠胃黏膜组织上皮细胞的铁死亡，降低KEAP1的表达，升高P62蛋白与NRF2的蛋白表达，激活该信号通路，发挥对铁死亡的拮抗作用。
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