摘要
目的:本研究旨在基于网络药理学分析和实验验证，揭示山仙颗粒诱导人结直肠癌SW480细胞凋亡的分子机制。 方法:1.网络药理学研究：通过中药网络药理学数据和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)查询和文本挖掘筛选山仙颗粒（Shanxian Granules，SXG）候选活性化合物，利用 Swiss target prediction平台预测化合物相关靶标蛋白；访问GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank数据库确定结直肠癌(ColorectalCancer,CRC)相关靶点，经Venn平台获得山仙颗粒治疗结直肠癌候选靶点；通过Cytoscape软件构建山仙颗粒-结直肠癌靶点网络；对山仙颗粒治疗结直肠癌候选靶点进行GO和KEGG富集分析。2.细胞培养及干预：体外培养人结直肠癌SW480细胞，常规培养、传代、冻存、复苏，于倒置显微镜下进行细胞计数，并观察细胞生长情况；当细胞处于对数生长期时用山仙颗粒醇提物和5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）干预培养后备用。3.将细胞分为四组检测：Control组、SXG组、5-FU组、SXG+5-FU组，使用CCK-8法检测SXG、5-FU干预SW480细胞并测出IC50值，选取SXG和5-FU的IC50值药物浓度组成SXG+5-FU组并测量SXG+5-FU组干预SW480细胞的细胞凋亡情况。4.应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡的变化情况。5.应用RT-qPCR技术检测各组细胞中Caspase3、Caspase8mRNA的表达情况。6.应用Western Blot法检测细胞中Caspase3、Caspase8蛋白的表达情况。 结果:1.通过筛选共获得275个SXG所有活性成分对应的靶基因和615个CRC靶基因，取交集共得到32个相同靶基因。包括凋亡相关的Caspase1、Caspase3、Caspase8、Bax、AKT1基因；增殖相关VEGFA、EGF、EGFR；免疫相关IL1B、IL6等相关基因，通过KEGG和GO富集分析中药复方山仙颗粒与Caspase信号通路的上游Caspase8和下游的Caspase3相关。 2. 镜下观察传代后SW480细胞的生长状态，发现在传代的第二天80%的细胞由圆形生长为梭形，初步建立细胞的基本形态且生长较为稳定，故选择种板后24h进行各组的加药干预，并在干预后48h检测各组细胞数据。 3. CCK-8法检测各组细胞增殖情况，利用Bliss法计算山仙颗粒IC50为0.05g/ml，氟尿嘧啶IC50为8μg/ml，本研究选择各药物的IC50值作为后续实验的标准药物浓度。 4. 流式细胞实验结果示：SXG组SW480细胞凋亡率为21.76%；5-FU组SW480细胞凋亡率为29.22%；SXG+5-FU组SW480细胞凋亡率为36.86%；Control组SW480细胞凋亡率为9.10%。相比Control组，SXG组细胞凋亡率具有统计学差异（P＜0.05）；相比Control组，5-FU组和SXG+5-FU组均能显著增加细胞的凋亡率（P＜0.01）;相比SXG组，SXG+5-FU组凋亡率升高（P＜0.05）；相比5-FU组，SXG+5-FU组凋亡率升高（P＜0.05），具有统计学差异（P＜0.05）。 5. RT-qPCR实验结果示：相比Control组，SXG组可升高Caspase3 mRNA的表达量，具有统计学差异（P＜0.05）；相比Control组，5-FU组、SXG+5-FU组可显著升高Caspase3 mRNA的表达（P＜0.01）；相比SXG组、5-FU组，SXG+5-FU组Caspase3 mRNA表达量增高，具有统计学差异（P＜0.05）；相比Control组，5-FU组、SXG+5-FU组可增加Caspase8 mRNA表达量（P＜0.05），SXG组也可增加Caspase8 mRNA表达量但无统计学差异。相比SXG组，5-FU组、SXG+5-FU组可增加Caspase8 mRNA表达量（P＜0.05），SXG+5-FU组比5-FU组Caspase8 mRNA表达量高（P＜0.05）。6. Western Blot实验结果示：相比Control组，5-FU组和SXG+5-FU组可显著升高Caspase3的表达（P＜0.01）；相比Control组，SXG组可升高Caspase3的表达，具有统计学差异（P＜0.05）；相比SXG组、5-FU组，SXG+5-FU组Caspase3表达增高，具有统计学差异（P＜0.05）；相比SXG组，5-FU组、SXG+5-FU组可增加Caspase8表达（P＜0.05），SXG+5-FU组比5-FU组Caspase8表达量高（P＜0.05）；相比Control组，5-FU组、SXG+5-FU组可增加Caspase8的表达（P＜0.05），SXG组也可增加Caspase8表达但无统计学差异。 结论:1.使用网络药理学方法发现中药复方山仙颗粒能够作用于Caspase3、Caspase8信号靶点。 2.山仙颗粒可以通过促进人结直肠癌SW480细胞内上游Caspase8的表达，激活Caspase信号通路，上调下游Caspase3的表达，从而诱导人结直肠癌SW480细胞的凋亡。
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