NETL
摘要
目的: 缺乏神经血管营养的关节软骨受损后常常难以自我修复。同种异体骨软骨移植技术可有效快速修复运动性软骨缺损，是国外治疗膝关节软骨缺损最常用的措施之一。移植软骨组织活力的高低是保证OCA移植手术临床效果的关键，在保证软骨组织活力的前提下尽可能的延长软骨组织保存时间对于提高OCA移植手术治疗效果及预后具有重要临床意义。滚压力学加载装置能够模拟人体运动，通过滚轮滚压软骨组织，模拟软骨组织在体内的过程，提高体外软骨组织保存效果。低强度超声能够作为一种机械波传递机械振动能量，给予组织一定的力学刺激。本研究利用转录组测序和生物信息学分析，寻找滚压力学刺激提高体外保存软骨组织活力的潜在蛋白及相关通路，同时通过细胞存活率，组织学评估，力学等检测方法探究低强度持续性超声是否可以提高体外游离软骨组织保存活力，推动力学刺激方法在软骨组织库的应用。 材料与方法: 本实验共有两部分。 第一部分 基于转录组测序对滚压力学刺激调控软骨组织活力基因及相关功能的分析 在无菌环境下获取猪膝关节骨软骨柱，使用力学加载装置，对猪膝关节骨软骨柱施加额定频率、压力、时间的力学滚压刺激。去除软骨下骨，提取软骨组织的 RNA进行转录测序，获得的原始数据经统计学处理后，使用Gene Ontology分析描述基因和基因产物的特性，包括细胞组分、分子功能和生物过程3个基因功能；用京都基因与基因组百科全书数据库对各个信号通路上的DEGs数目和富集情况进行分析；应用在线数据库STRING和Cytoscape软件分析DEGs之间的相互作用并制作蛋白相互作用网络图。在转录组测序获取的差异基因结果中中随机挑选 3 个基因进行荧光定量PCR检测。 第二部分 低强度持续性超声刺激对体外保存软骨组织活力的影响 在无菌环境下获取猪膝关节骨软骨柱60枚（负重区），分组为超声刺激组，静态保存组，每组30枚。超声刺激组每天给予TSMU力学刺激法的超声力学刺激，静态组不做处理。两组均放置于 4℃冰箱中低温保存，每 3 天换液一次。试验周期共 28天，分4个时间点进行检测（每个阶段均在第7天末进行相关检测）。4个时间点均检测两组的骨软骨组织细胞存活率；第2、4时间点行HE染色，甲苯胺蓝染色，番红O-固绿染色，力学检测（杨氏模量）；在保存第14天，超声力学刺激2小时后，取去除软骨下骨的软骨组织行蛋白质印记法检测ERK蛋白。 结果: 第一部分：基于转录组测序对滚压力学刺激调控软骨组织活力基因及相关功能的分析 1. 差异基因筛选 通过对超声刺激组和静态保存组的软骨组织进行转录组测序分析，共取得DEGs 204个，其中上调基因51个，前10位分别是分别是：GCNT1、COCH、TRMT13、CEP135、PLEC、SMOC2、TPD52L1、RSC1A1、PTGS2、KPNA2。下调基因153个，前10位分别是：MSMP、CCN3、FAIM2、TINAGL1、MMP3、EFEMP1、KIAA1755、PIK3IP1、ENSSSCG00000003839、SERPING1。 2. 差异基因GO富集性分析 结果显示：在生物过程分组，对刺激的反应、细胞对刺激反应和多细胞生物过程等是显著富集类型；在分子功能分组，信号受体结合、分析换能器活性和信号接收活性等是显著富集类型；在细胞组分分组，细胞外区域、细胞外区域部分和细胞外间隙等是显著富集类型。 3. 差异基因的KEGG富集分析 结果显示与醛固酮的合成与分泌，脂肪的代谢吸收，钙信号通路等方向显著富集。 4. 差异基因蛋白质相互作用网络图 204个DEGs能够形成复杂的蛋白相互作用网络，根据蛋白相互作用网络图筛选DEGs作为滚压载荷力学调控游离软骨组织活力的潜在关键基因。前15位DEGs分别是：PENK、AGT、MMP9、MX1、MX2、IRG6、ISG15、HERC5、UBE2L6、KIF20A、NEK2、CDCA3、KIF4A、CDCA4、IRF7。 5. 荧光定量PCR 从204个有差异表达的基因中随机选择3个基因，分别是MMP9、AGT、RAF1，进行荧光定量PCR检测，其结果趋势与高通量结果相符（P＜0.05）。 第二部分：低强度持续性超声刺激对体外保存软骨组织活力的影响 1. 细胞存活率：在第7和14天时，超声刺激组细胞成活率明显高于静态保存组（P＜0.05）。在第21天和28天，超声刺激组和静态保存组细胞成活率没有显著区别（P＞0.05）。 2. 组织学染色：（1）Hamp;E染色：在第14天时，超声刺激组与静态保存组相比，具有较为明显的软骨层次，整体软骨染色基质丰富，超声刺激组浅层、深层软骨染色明显优于对照组，细胞基质丢失少；在第28天，超声刺激组和静态保存组两组没有明显差异，均形态学表现差，基质淡染。（2）番红O-固绿和甲苯胺蓝染色：在第14天时，超声刺激组与静态保存组相比，具有较为明显的软骨层次，整体软骨染色基质丰富，超声刺激组浅层、深层软骨染色明显优于对照组，细胞基质丢失少（P＜0.05）；在第28天，超声刺激组和静态保存组两组没有明显差异，均形态学表现差，基质淡染（P＞0.05）。 3. 生物力学检测：在第14天，超声刺激组与静态保存组相比，具有较好的杨氏模量（P＜0.05）；在第28天，超声刺激组和静态保存组两组没有明显差异（P＞0.05）。 4. Western blot检测情况：超声刺激组与静态保存组相比，ERK蛋白在组织中高表达（P＜0.05）。 结论: 1、发现了滚压力学刺激调控游离软骨组织活力的关键基因，并分析了DEGs参与的生物学过程及相关信号通路。 2、对保存液中的软骨组织施加持续性低强度超声刺激可以在2周内提高软骨细胞活力，维持细胞外基质含量及力学性能。
关键词
运动性软骨缺损/同种异体骨软骨移植/软骨组织/体外保存/滚压力学刺激/低强度超声刺激/软骨细胞活力引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
运动医学导师
亓建洪学位年度
2021学位授予单位
山东第一医科大学语种
中文中图分类号
R8