水稻土是在长期淹水种稻条件下，受到人为活动和自然成土因素的双重作用，而产生水耕熟化和氧化与还原交替，以及物质的淋溶、淀积，形成特有剖面特征的土壤。水稻土是关乎我国粮食安全的重要土壤资源，据最新统计，我国水稻种植面积位居世界第二，而产量世界第一。慈溪千年时间序列水稻土是研究土壤成因变化速率和方向的有效工具，也可以作为一种非常有价值的生态体系，研究长期农业实践管理下微生物群落及功能、代谢物组成及代谢特征与土壤演变的关系。同时，在对时间序列水稻土代谢物与微生物的研究中，测定方法的准确性、精密性、灵敏性及线性是决定测定结果质量的关键因素。但现有代谢组学方法对土壤基质存在专一性差、检测通量低及代谢物种类覆盖度少等不足。此外，传统的土壤微生物磷脂脂肪酸分析（PLFA）方法对磷脂的分离不完全，存在甜菜碱脂类的干扰，需要利用均相催化剂强碱（NaOH）或强酸（HCl）等进行转酯化，导致反应耗时且污染环境。因此，建立新颖的土壤分析方法，并将其应用于研究滩涂到水稻土演变过程中代谢物与微生物对时间序列的响应显得尤为重要。 本研究以慈溪千年时间序列水稻土为模型生态系统，对PLFA方法与土壤代谢组学进行改进与构建，结合土壤生物化学性质、微生物群落组成及功能、代谢物组成及代谢特征等进行研究，分析千年时间序列滩涂到水稻土演变过程中围垦时间对土壤微生态的影响，进一步明确时间序列水稻土中代谢物与微生物的响应变化规律及机制。研究内容对全面了解农业土壤的长期发育规律，促进稻田农业生态系统健康和可持续发展具有重要的理论与应用价值。主要研究结果如下： （1）改进前处理技术，获得了一种环境友好、快速、准确和精确的PLFA土壤微生物群落评估方法。前处理技术主要包括氧化锆固相萃取净化和硅藻土多孔材料的热裂解辅助转酯。氧化锆固相萃取能完全分离磷脂与其他极性脂类，回收率达到 94%。热裂解辅助转酯的最优条件为反应温度370℃，反应时间8 min，酰基受体甲醇的用量0.2 mL，该条件下不会导致脂肪酸甲酯产生热裂解副反应。改进的方法对杂质（水和有机共提物）具有较高的耐受性，且硅藻土可以重复使用5次。方法验证表明线性、重复性和再现性等相关指标表现良好。将改进的PLFA方法应用于分析千年时间序列滩涂到水稻土演变过程中微生物群落的变化，结果表明，总微生物量、细菌、革兰氏阳性菌等绝对丰度在0-60年或300显著增加，与地力的持续增加相关，而细菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等相对丰度和微生物Alpha多样性指数仅在0-6年变化明显，表明PLFA微生物群落相对组成在6年趋于稳定。除土壤全氮和有机质外，土壤微生物群落组成还受到与氮循环代谢相关的土壤关键酶的正向驱动。综上，氧化锆固相萃取结合热裂解辅助转酯的PLFA分析方法是一种分离能力强、环境友好、高效、准确及稳定的方法，且该方法还可应用于土壤中糖脂和甜菜碱脂的分析研究。 （2）构建了一种简单、精确和可行的GC-MS环境拟靶向代谢组学方法，用于对土壤环境进行代谢轮廓评估。引入微波辅助衍生化和拟靶向数据采集技术，可以显著提高方法对土壤基质的专一性和增加样品检测的通量、代谢物检测的覆盖度。构建的方法对Fe3+、SOM、NaCl等杂质的耐受性较好，表现出较低的基质效应。同时，微波辅助肟化与硅烷化仅需5 min和9 min，能同时鉴定与定量时间序列水稻土中26类具有不同化学结构的184种代谢物。方法验证表明，环境拟靶向代谢组学在线性（相关系数gt; 0.99）、重复性（相对标准偏差lt;20%）、重现性（相对标准偏差lt; 25%）、稳定性（18 h内相对偏差lt; 10%）和灵敏度（信噪比提高16-110）等方面具有良好的性能。与微生物PLFA分析相比，代谢物轮廓分析具有更高的灵敏度区分土壤生态中微小的变化。 （3）千年时间序列滩涂到水稻土的形成过程中，在 60 年内转变为相对稳定的稻田生态系统，碳、氮的输入和流失达到相对平衡，大部分物理、化学性质（总养分和部分有效养分）接近稳定状态。慈溪千年时间序列水稻土在土壤生物化学性质的变化中，土壤质地变化较小，pH值持续降低，SOM持续增加并在后期相对稳定。水稻土中全氮、全磷、水解氮等含量均相对较高，随时间序列的增加而增加，但在 6年水稻土中存在降低趋势，60年后增加平缓，全磷与速效钾（300-1000 年）在后期持续降低。时间序列水稻土在演变初期脱盐、脱钙现象明显，而有效铜、锌、锰和铁等变化规律不明显。土壤酶活性脲酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、硝化还原酶、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶和过氧化氢酶、脱氢酶、多酚氧化酶分别表现为增加和减少趋势，增加趋势的碳氮关键酶主要与 SOM的含量增加密切相关，而减少趋势的抗逆关键酶及土壤多酚氧化酶主要与长期淹水导致稻田的低氧抑制作用有关，也可能是微生物过程与酶活性之间的解耦效应。总之，随水稻土时间序列的增加，其环境压力胁迫减少且进一步适应水稻环境，但在有机碳、氮积累的同时也造成一定的负效应，如pH随时间序列持续降低，总磷在演变后期显著降低。 （4）土壤代谢物可以推断慈溪千年时间序列水稻土的演变，每个时间点都有其独特的土壤代谢谱且60年内水稻土代谢物的组成趋于稳定。从滩涂到水稻土的演变，筛选得到42种特征代谢物作为判别差异的重要代谢物，其中甘氨酸、支链十五酸、香草醛、松二糖、奎尼酸和2, 5-二羟基苯甲酸为中枢代谢物。富集分析表明：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，丁酸代谢，精氨酸生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，淀粉和蔗糖代谢以及柠檬酸循环是千年时间序列水稻土主要改变的代谢途径。代谢物与生物化学性质和微生物之间的变化具有较好的一致性。千年时间序列水稻土中的酶活性、理化性质和微生物共同导致了土壤代谢物的变化，四者之间存在密切关联性。 （5）滩涂到水稻土的时间序列演变同时影响了土壤微生物多样性指数、群落结构和组成，进而改变其代谢功能状态。随滩涂到水稻土的演变，微生物Alpha多样性从0到60年呈增加趋势，随后趋于稳定并有一定程度降低；微生物群落的 Beta 多样性在 0、6 和60-300-1000年之间差异明显。真菌Alpha多样性指数与群落结构演变规律都弱于细菌。基于FAPROTAX和FunGuild代谢功能预测表明，慈溪水稻土时间序列的变化显著影响了土壤细菌及真菌功能基因的代谢相对丰度。在细菌代谢功能变化中，滩涂土壤细菌的光合营养、硝化还原、硫酸盐呼吸等代谢功能基因相对丰度显著较高；水稻土形成初期（6 年），化能异养、需氧化能异养、甲基营养、烷烃降解等显著较高；水稻土形成后期（60-1000 年），动物寄生或共生代谢、发酵、硝化等显著较高。在真菌代谢功能变化中，滩涂土壤真菌的光合代谢占主导；水稻土形成后期（60-1000年）主要为排泄物腐生菌、叶片腐生生物、动物病原-土壤腐生生物、丛枝菌根等代谢功能基因相对丰度显著较高。 综上所述，本研究建立了快速、稳定的土壤PLFA分析方法与高特异性、检测通量和广代谢物覆盖度的土壤环境拟靶向代谢组学。结合新方法与高通量测序技术，明确了慈溪千年时间序列水稻土的理化性质和酶活性随滩涂到水稻土的演变而规律性变化，进而影响了土壤微生物群落与功能，以及代谢产物组成与代谢途径的变化。千年时间序列水稻土中的酶、理化指标和微生物共同作用是导致土壤代谢物发生变化的关键，并进一步揭示了四者之间互作关系。研究结果能为土壤研究提供了新的分析技术手段，也能为稻田农业生态系统的健康和持续发展提供了理论支撑。
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