摘要
骨肉瘤是最常见的骨组织恶性肿瘤之一，可分为原发性和继发性，预后差。原发性骨肉瘤多出现在儿童和青少年中，继发性骨肉瘤在老年人群中多见。最初，骨肉瘤的治疗主要以手术切除加重建为主。然而由于早期发生转移及局部容易复发等原因，骨肉瘤患者行手术切除术后5年生存率仅为20%左右。1970年代以后随着化疗药物(甲氨蝶玲/阿霉素/顺铂等)的出现，对手术后的骨肉瘤患者相继实施单纯术后化疗和新辅助化疗方案(术前诱导化疗+术后辅助化疗)，取得了良好的治疗效果，术后5年生存率达到60%-70%左右。然而，在过去四十余年的时间里，骨肉瘤的治疗方案没有太大的进展，但是骨肉瘤对化疗药物的耐药性以及化疗药物本身的副作用日渐成为治疗过程中的突出问题，严重影响了骨肉瘤的临床疗效。因此, 为了克服肿瘤细胞的耐药性,进一步改善骨肉瘤的临床治疗效果，有必要研究新型抗骨肉瘤的治疗方法和靶向药物。本文紧跟当前研究热点，一方面研究了具有骨靶向性能的光热纳米材料(聚多巴胺/阿仑膦酸钠)协同化疗药物(阿霉素)进行抗骨肉瘤的治疗效果。另一方面利用当前转录组测序数据和药物库数据，探究了基于复制应激反应相关靶点的新型抗骨肉瘤药物。 第一部分：本部分研究的目的是开发一种具有光热效应的骨靶向纳米材料负载阿霉素进行协同抗骨肉瘤治疗。该纳米材料可同时满足骨靶向、光热效应协同化疗药物进行肿瘤杀伤、破骨细胞抑制的治疗需求。 首先利用聚多巴胺 (PDA) 的多功能表面与具有骨靶向作用的阿仑膦酸钠(ALN)进行迈克尔加成反应，合成 PDA-ALN 纳米颗粒。然后通过π-π堆积和/或氢键结合在其表面装载阿霉素(DOX)，经过透射电子显微镜、动态光散射等表征PDA-ALN和PDA-ALN/DOX纳米粒子的理化特征。在体外通过紫外分光光度计、808nm近红外(NIR)、激光器红外热成像仪等验证了PDA-ALN的光热效应以及PDA-ALN/DOX在光热效应下的DOX释放情况。 然后，通过将合成的纳米颗粒与NIH3T3细胞共孵育，利用MTS试验验证了PDA-ALN体外具有良好的生物相容性，同样利用MTS实验和AO/BE染色，验证了PDA-ALN/DOX在体外对143B和U2OS细胞具有良好的杀伤效果。利用小鼠原代培养的骨髓间充质干细胞分别与PBS、ALN、PDA、PDA-ALN共孵育下进行破骨细胞分化诱导。发现 PDA-ALN 在体外具有抗破骨细胞形成的作用。 最后利用荷瘤小鼠模型进行体内骨靶向、肿瘤杀伤、光热效应、抗骨溶解、破骨细胞抑制及生物相容性等情况进行了实验验证，最终证明 PDA-ALN/DOX纳米颗粒在抗骨肉瘤方面具有良好的治疗效果和较好的生物相容性。 第二部分：骨肉瘤是一种高侵袭性恶性肿瘤，肿瘤细胞长期处于高速增殖状态且易发生肺转移，高水平复制应激(Replication Stress, RS)引发的基因组不稳定性是其主要特征之一，并严重影响了骨肉瘤的临床药物使用和患者预后生存情况。因此该部分研究聚焦骨肉瘤细胞中持续存在的 RS 引发的复制应激反应(Replication-stress response, RSR)寻找新的治疗靶点并挖掘潜在的抗肿瘤药物。 首先，从 Therapeutically Applicable Research To Generate Effective Treatments (TARET)肿瘤数据库和 Gene Expression Omnibus (GEO)数据库下载最新的骨肉瘤相关mRNA测序数据集和临床样本信息，清洗去除生存信息缺失的样本数据后分别作为训练集和验证集备用。 然后通过目前已报道的高侵袭性肿瘤 RSR 生物标志物(NAT10、DDX27、ZNF48、C8ORF33、MOCS3以及MPP6)将TARGET数据集分别划分为高、低表达组并计算差异表达基因，此处以 PValue ＜ 0.05 作为阈值筛选，降低该阶段统计学的Ⅱ型错误率。通过 GSEA 分析对各组 DEGs 进行功能注释，明确下游生物功能变化以及与RSR的相关性。本研究将各组均出现的差异表达基因定义为复制应激反应相关基因(RSGs)，并通过LASSO构建L1正则化线性回归模型对影响患者生存的主要特征进行提取，然后通过构建多因素 Cox 风险比例回归模型，评价各种主要特征对骨肉瘤患者预后的影响。通过GEO数据库验证集检测模型效率。基于上述结果，采用L1000FWD、DGIdb数据库挖掘潜在治疗药物，最终发现TCF7L2、SLC27A4、PCSK5、NOL6、CHCHD4、EIF3B、SCO1共7个RSGs 对骨肉瘤的发生发展和病人的生存预后存在较大影响。通过将这些 RSGs与上述两个药物库比对后，发现瑞格列奈、他克莫司、西罗莫司、环孢霉素、氢氯噻嗪和小分子物质VU-0365117-1可能对骨肉瘤存在治疗作用。其中除西罗莫斯已有相关研究外，以瑞格列奈的相互作用评分最高，最具有潜在的抗骨肉瘤作用。
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