摘要
金黄色葡萄球菌是一种在临床上能够引起人类和动物皮肤及软组织化脓性感染的人畜共患病原体，是一种常见的革兰氏阳性球菌，广泛存在于人体和动物的皮肤、呼吸道中。虽然抗生素是治疗金黄色葡萄球菌感染最有效的方法，但随着越来越多耐药株的出现，寻求一种能控制金黄色葡萄球菌感染的替代方法十分必要，其中疫苗是较有潜力的替代方法之一。金黄色葡萄球菌可以通过凝集因子Clumping factor A（ClfA）黏附在宿主组织上引起细胞感染，因此定位ClfA蛋白的抗原表位是开发抗金黄色葡萄球菌抗体的重要步骤之一。目前已开发出针对ClfA的抗体主要是单克隆抗体，但其中大多数与ClfA结合的亲和力都不高，并且生产成本较高。而纳米抗体是一种只有重链结构区组成的抗体片段，因为在结构上没有轻链，所以具备了较低的免疫原性、较高的耐热稳定性、优良的溶解度、分子量小（15kDa）等独特性质。目前，纳米抗体已在原核生物、真核生物等多种系统中都有高效表达，在抗体药物中具有独特的优势。 在本研究中，在酿酒酵母中构建了一个库容量大小为5×108的纳米抗体文库，利用酿酒酵母表面展示技术，通过流式细胞术筛选出了针对ClfA抗原的纳米抗体ClfA Na，测得其Kd值为27.65nM。为进一步提高ClfA纳米抗体的亲和力，本研究基于Cl fA Na利用易错PCR技术构建了一个库容量大小为108的纳米抗体突变文库，继续通过流式细胞术筛选出了一种针对ClfA抗原亲和力提高了3.47倍的纳米抗体ClfA mNa。最后通过细胞实验，发现与单独使用抗原ClfA蛋白刺激猪肾脏细胞的检测结果相比，联合使用纳米抗体ClfA mNa进行刺激可以显著降低IL-1β、IL-8、IFN-γ等细胞因子的转录水平，说明ClfA mNa针对ClfA抗原具有良好的中和活性。最后，利用AlphaFol d2对纳米抗体结构进行模拟，再利用DS软件中的ZDOCK和RDOCK对模拟的纳米抗体结构与ClfA进行分子对接，发现纳米抗体ClfA m-Na可能是通过与Fg竞争性结合C lfA从而减弱了ClfA的黏附作用。由此可见，本研究筛选出的纳米抗体为针对ClfA的抗体药物开发提供了良好的实验支撑。
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