摘要
蛋白质翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）可提高细胞内蛋白质组的复杂性，是细胞调节生命活动的重要分子机制。遗传密码子扩展技术（Genetic Code Expansion,GCE）可将不同结构和功能的非天然氨基酸（Noncanonical amino acid,ncAA）引入目标蛋白，为PTM的基础和应用研究提供开拓性工具。然而，一些PTM具有较为复杂的结构，难以通过ncAA直接编码。本论文针对Asp的异构化/Asn脱氨基产生的异天冬氨酸（Isoaspartate,isoAsp）修饰以及Asn的N-糖基化这两类复杂PTM，通过GCE技术与化学修饰相结合，开发了一种半合成策略，实现了这两类PTM（或类似物）在蛋白质中的位点选择性构建，并基于此开展了一定的应用研究。 首先，本文针对结构独特的Asp衍生物L-天冬氨酸-4-苄酯（(L-aspartate-4-benzyl ester,BnD），开展了对吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（Pyrrolysyl-tRNA synthetase,PylRS）的筛选，获得可编码BnD的PylRS变体。实验表明，BnD可高效编码进入蛋白，在生理条件下具有良好的稳定性，为本课题的后续研究奠定了必要基础。 受isoAsp酶修复过程的启发，本文通过将BnD引入蛋白质的柔性区域，发现BnD与其C端氨基可迅速发生分子内亲核取代反应，形成琥珀酰亚胺（Succinimide,Suc）中间体，该中间体经水解形成isoAsp或Asp。并揭示这种转化受C端氨基酸属性影响，其中Gly、Ser、Thr等氨基酸有利于转化的发生。同时，使用蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶（Protein L-isoaspartyl methyltransferase,PIMT）对产生的isoAsp进行修复，证明isoAsp的成功引入。并证实了isoAsp能够赋予蛋白质明显的蛋白酶耐受性。最后，基于isoAsp赋予的蛋白酶耐受以及独特的拓扑结构，我们认为isoAsp在多肽药物研发中具有巨大应用潜力，于是发展了BnD的噬菌体展示方法，针对PIMT进行亲和力筛选实验，初步证明了isoAsp噬菌体展示的可行性。 针对N-糖基化修饰问题，本文基于酰基肼与还原性糖间的化学选择性反应，设计了一种使用廉价易得的还原性糖对蛋白质进行位点选择性修饰的方法。实验中，我们对编码的BnD进行肼解，使之定量转化为丙氨酸-β-酰肼（Alanine-β-hydrazide，Aβz）。Aβz能够与单糖、二糖、三糖及四糖在内的各种还原性糖反应，效率和特异性受电子和立体效应影响。其中与N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）的反应具有高效性（79%）和优秀的特异性，并发现这种修饰能够明显影响蛋白质的热稳定性。进一步，我们以Aβz-GlcNAc为起点，通过酶促转糖基化，构建了复杂聚糖修饰的均质糖蛋白。本方法突破了蛋白质N-糖基化的氨基酸序列限制，为人工设计糖蛋白提供了便利，具有一定的应用价值。 综上所述，本文基因编码了新颖的Asp衍生物，并以此为基础实现了isoAsp在蛋白质中位点选择性构建，是在蛋白质中引入β-氨基酸的创新型方法，为isoAsp修饰的基础和应用研究提供了开拓性工具。另一方面，本文利用BnD，实现了还原性糖对蛋白质的位点选择性修饰，为糖基化蛋白质的制备提供了新方法。
NETL