摘要
全氟/多氟烷基化合物（PFAS）是一类人工合成的化合物，其作为表面活性剂，已经广泛应用于生产和生活中。由于巨大的使用量和稳定的化学性质，已经在水、土壤、灰尘等环境介质，以及野生动物和人体中检测到一万多种 PFAS。不同于传统的疏水性有机污染物，许多PFAS容易在肝脏等富含蛋白质的动物组织中积累。例如，全氟辛酸、全氟辛基磺酸倾向于在血液和肝脏中积累。PFAS经血液运输进入肝脏，在肝脏中积累并引起代谢紊乱、致癌基因表达上调等肝脏毒性。研究表明，PFAS与蛋白的结合对其生物积累水平有重要贡献。然而，在动物组织中，PFAS与不同组织蛋白间的相互作用、胞内蛋白和膜蛋白间的作用等对其生物积累和组织分配的调控机制尚不清楚。已经有研究报道了PFAS与人血清白蛋白（SA）的作用，但这难以解释其在人体肝脏中的积累程度，阻碍了对其肝脏毒性和作用机制的研究。目前研究较多和有毒性数据的PFAS种类只有几十种，而绝大部分PFAS尚缺乏研究，新型PFAS肝脏积累情况的数据缺口巨大，其潜在的蓄积潜力不得而知。因此，本文利用动物暴露实验、平衡透析实验、痕量分析、分子相互作用和机器学习等技术，阐明不同蛋白分子在PFAS肝脏积累中的调控作用，并建立了快速评估PFAS蓄积潜力的方法，为PFAS的健康风险评估和全新PFAS的研发提供了理论支撑和重要参考。主要结论如下： （1）首先，将雄性CD-1小鼠暴露于11种常见PFAS，研究其在小鼠肝脏中的积累特征。虽然血清中全氟磺酸（PFSAs）的蓄积潜力高于相同碳链长度的全氟羧酸（PFCAs），但是PFSAs的肝-血分配系数（RL/S）低于PFCAs，说明PFSAs更倾向于分配在血液中。平衡透析竞争实验表明PFAS在肝脏和血清中的分配与PFAS和肝脏蛋白、血清蛋白之间的相互作用有关；而两种组织中高表达的胞内蛋白，脂肪酸结合蛋白（L-FABP）和SA，在这种分配中发挥了关键作用。与只考虑L-FABP对PFAS的结合相比，同时考虑L-FABP和SA对PFAS的结合显示出与RL/S更强的相关性，表明PFAS在肝脏和血液之间的分配是由L-FABP和SA这两种胞内蛋白对PFAS的竞争性结合介导的。在此基础上，建立了PFAS与蛋白结合的解离常数（Kd）与RL/S之间的关系式（拟合系数r2为0.75），基于该关系式，可以通过测定血液中PFAS的浓度水平预测其肝脏积累程度，为评估PFAS对肝脏的毒害风险提供重要依据。 （2）除了胞内结合蛋白，膜蛋白对PFAS的生物积累也起着关键作用。肝脏中的分化簇36（CD36）是一个典型的膜蛋白，为研究膜蛋白在PFAS肝脏积累中的作用，以CD36为模式膜蛋白，探究其在PFAS跨膜转运的作用。由于难以获得纯的膜蛋白，CD36与PFAS的特异性结合在细菌裂解液中被证实。之后通过培养CD36高表达的大肠杆菌（CD36-BL21），证明这种特异性结合可以导致PFAS在体内的积累。相比野生型大肠杆菌，发现PFAS在CD36-BL21中的积累量显著上升,并且蓄积潜力随着 PFAS 链长增加而增大。为了进一步探明CD36在PFAS跨膜转运中的作用，选择与CD36有较强结合能力的全氟十二酸（PFDoA）作为代表性PFAS，用CD36的特异性抑制剂磺基-N-琥珀酰亚胺基油酸盐（SSO）处理CD36-BL21，发现PFDoA在CD36-BL21中的积累量显著降低。并且相对于未经SSO处理的CD36-BL21，因暴露PFDoA导致的细菌丝状化现象也明显减弱。为进一步探明CD36是否参与PFAS在动物肝脏积累中的跨膜转运，以PFDoA为模式化合物，对雄性CD-1小鼠进行暴露。发现对于先灌胃SSO，再暴露PFDoA的小鼠，其肝脏中PFDoA的含量显著低于不灌胃SSO的小鼠，但PFDoA在血清中的浓度却明显增加，这表明CD36确实调控了PFDoA的肝脏积累。在同时考虑CD36与PFAS的相互作用之后，结论（1）中PFAS在肝脏和血液间分配的关系式的 r2增加到 0.88。本研究揭示了膜蛋白在 PFAS 的跨膜转运和肝脏积累中的关键作用。 （3）环境中存在大量的新型 PFAS，但缺乏其在肝脏中蓄积潜力的相关研究，亟待开发一种高效评价其肝脏蓄积潜力的方法。考虑到L-FABP在PFAS肝脏积累中具有重要作用，以 PFAS 与 L-FABP 结合的解离常数 log Kd FABP为评价指标，对PFAS在肝脏中的蓄积潜力开展评估。环境介质中的多种PFAS同时进入人体肝脏后会竞争结合数量有限的蛋白活性位点。为模拟这种复合效应，将L-FABP 与多种 PFAS 标品混合孵育，通过超滤法同时测定了多种 PFAS 的 log Kd FABP。发现 PFCAs 和 PFSAs 同系物的log Kd FABP随着链长增加而先减小后增大。然而对于其他类型的PFAS，由于同系物数量有限，很难阐明链长等化学结构对log Kd FABP的影响。因此，利用机器学习建立 log Kd FABP与 PFAS 的描述符之间的回归模型，以更准确的描述 PFAS 的化学性质与 log Kd FABP的关联。为了提高模型稳定性，将三类真实环境介质中的PFAS样品分别与L-FABP孵育，结合可疑靶向分析测得更多种类 PFAS 的 log Kd FABP。利用在线学习的方法，建立了性能良好的极致梯度提升树回归模型，测试集的决定系数达到0.76。其中，蛋白质与 PFAS 的浓度比值和与电负性和极化性相关的描述符对 log Kd FABP 有较大贡献。利用该模型预测了美国环境保护署收录的 9660 种 PFAS 的 log Kd FABP，已报道PFAS 的 log Kd FABP与预测值相关性高达 0.90，证明了该模型的准确性。模型可解释性算法表明，具有较多碳氟键以及含有氧原子的PFAS具有较高的肝脏蓄积潜力。进一步为了评估环境中尚未发现的PFAS的肝脏蓄积潜力，利用深度学习方式生成了 83393 种全新的 PFAS，并对其 log Kd FABP进行了预测。该研究对具有低肝脏蓄积潜力PFAS的从头设计和高肝脏蓄积潜力PFAS的风险识别有重要意义。
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