摘要
蛋白的质量控制是生命体有效保证蛋白正确、高效折叠，清除错误折叠或受损蛋白，防止聚集产生毒性的重要机制。细胞内各细胞器为维持各自区域的蛋白质稳态进化出了各自不同的质量控制途径。叶绿体是植物特有的半自主性细胞器，细胞核基因组编码的叶绿体前体蛋白进入叶绿体后需要被正确折叠才能发挥功能，而当受到环境胁迫或外界刺激时，新生肽的折叠容易出错并发生聚集，而已正确折叠的蛋白也会因胁迫损伤而聚集，从而产生细胞毒性严重危害着生命体的健康，因此对叶绿体蛋白质量控制系统的研究具有重大意义。目前已知的叶绿体蛋白质量控制系统中有分子伴侣和蛋白酶参与其中，然而它们如何响应环境胁迫并快速作出反应来维持叶绿体蛋白稳态的分子机制尚不清楚。本论文以叶绿体内的分子伴侣HSP40-1和CLP蛋白酶系统为对象开展研究，其中cpHSP40-1存在于叶绿体基质中，隶属于分子伴侣一类，能够帮助蛋白折叠，CLP蛋白酶定位于叶绿体基质主要负责降解一些基质蛋白，共同参与维持叶绿体蛋白稳态。 细胞内的热激蛋白家族成员HSP40被报道在热胁迫下可以通过形成相分离凝集体的方式来维持细胞核的蛋白稳态。因此，本文首先通过对叶绿体蛋白cpHSP40-1自身启动子驱动cpHSP40-1蛋白融合GFP标签的转基因植株进行热胁迫处理，发现高温会诱发cpHSP40-1快速聚集，且可能形成了相分离凝集体。融合和光漂白恢复实验显示在植物正常生长温度（22℃）下，cpHSP40-1荧光漂白后可以快速恢复，并且光漂白所产生的蛋白损伤能够继续招募cpHSP40-1蛋白融合形成更大的液滴，证实了叶绿体内cpHSP40-1具有响应胁迫并发生相分离的能力；而热胁迫（37℃）长期处理下cpHSP40-1的光漂白后恢复能力极弱，表明长时间胁迫会导致异常相分离行为，并伴随着不可逆的蛋白聚集。为探究cpHSP40-1参与哪些蛋白的损伤修复，本文通过在22℃和37℃对cpHSP40-1融合Flag标签的转基因植株进行了免疫共沉淀结合质谱分析（IP-MS）。结果显示EX2、RCA、EDA9、THI、GluTR、GADPH和TKL1与cpHSP40-1相互作用，可能是cpHSP40-1的作用底物。进一步通过蛋白共定位及双分子荧光互补实验（BiFC）验证了cpHSP40-1与底物的相互作用，结果显示cpHSP40-1与这些蛋白均相互作用。为了探究cpHSP40-1是否参与热胁迫下这些底物蛋白的损伤修复，我们首先在原生质体内表达带有GFP荧光的底物蛋白并给予高温胁迫，结果发现环境温度从22℃到37℃改变的过程中，有些底物蛋白（如THI）发生聚集。当cpHSP40-1和底物同时存在时，强光照射所产生的的光损伤胁迫能诱发底物蛋白（如RCA）和HSP40-1发生共同聚集，这些结果表明胁迫条件下一些底物可以被招募到cpHSP40-1相分离形成的液滴中。随后，为确定液滴内的cpHSP40-1是否能够帮助底物进行折叠，本文进行了蛋白复性实验。将融合GFP荧光标签的非折叠态底物蛋白与cpHSP40、cpHSP70体外孵育后，我们观察到底物蛋白（如EX2、THI、GluTR、GADPH和TKL1）显现绿色荧光，且与cpHSP40-1和cpHSP70的荧光信号共定位于同一相分离液滴中，表明非折叠态的底物蛋白可以被招募到cpHSP40-1的液滴中，并在cpHSP70的帮助下被正确折叠。由于长时间胁迫会引起cpHSP40的异常相分离行为，导致蛋白不可逆聚集。因此我们通过分析已报道的叶绿体基质CLP蛋白酶系统的降解底物，通过比对发现cpHSP40的底物与CLP蛋白酶系统的降解底物有所重合，暗示CLP蛋白酶可能参与这些不可逆蛋白聚集体的清除过程。通过原生质体荧光共定位分析和BiFC实验对CLP与这些底物蛋白的互作进行验证，发现GluTR、EX2、RCA、TKL1、EDA9、THI均与CLP蛋白酶系统中负责识别底物的亚基CLPC1之间存在互作。同时本文也证明了CLP与cpHSP40-1之间也存在相互作用，并且cpHSP40-1各结构域的缺失均不能完全打破两者的互作，说明CLP与cpHSP40-1可能在相分离凝集体中通过多位点进行互作。为进一步探究CLPC1和cpHSP40在叶绿体蛋白质量控制过程中的生理功能，本文对clpc1突变体及cphsp40-1 RNAi株系进行了热胁迫处理，结果显示缺失CLPC1或cpHSP40均严重影响胁迫条件下的底物（如EX2）的重新折叠，这意味着CLP和cpHSP40-1对叶绿体蛋白的质量控制至关重要。 本论文提出叶绿体分子伴侣cpHSP40和基质CLP蛋白酶系统协同作用，在胁迫条件下通过cpHSP40介导形成的相分离凝集体完成对叶绿体蛋白的质量控制，对理解植物应对外界环境变化的分子机理提供了一定的理论基础。
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