摘要
茶叶中独特风味物质茶氨酸作为茶树中极具代表性的非蛋白氨基酸，是茶叶的鲜味成分之一。同时 L-茶氨酸具有出众的保健功能，已被食品、医药保健、日化等领域频繁应用。近年来，对 L-茶氨酸的研究热度不减。本研究采用全细胞催化和微生物发酵法生产 L-茶氨酸。过表达来源于 Methyloversatilis universalis 的 γ-谷氨酰胺甲胺合成酶、Escherichia coli. str. K-12 substr. MG1655 的聚磷酸激酶、Bacillus 的丙氨酸转氨酶、Camellia sinensis 的丙氨酸脱羧酶和 Saccharomyces cerevisiae 的谷氨酰胺渗透酶，以葡萄糖为底物通过微生物一步法发酵生产L-茶氨酸。主要内容如下： （1）构建 ATP 再生系统强化 L-茶氨酸生物合成。通过全细胞催化反应及最适条件探索发现工程菌Escherichia coli FD01的最适生产条件为：温度 30℃，pH 7.0，诱导剂 IPTG最适添加量为 0.5 mM，底物 L-谷氨酸和乙胺的最佳浓度为 200 mmol/L。工程菌 Escherichia coli FD02的最适生产条件为：温度 37℃，pH 7.0，诱导剂 IPTG最适添加量为 0.3 mM，底物 L-谷氨酸和乙胺的最佳浓度为 200 mmol/L。通过在 Escherichia coli FD02 中过表达 Escherichia coli 来源的聚磷酸激酶，构建 ATP 再生系统， Escherichia coli FD02中 L-茶氨酸的产量比 Escherichia coli FD01提高了 13.4%。最后，工程菌Escherichia coli FD02在 1 L生物反应器中全细胞催化合成了 1.86 g/L L-茶氨酸。 （2）茶氨酸转运蛋白过表达强化茶氨酸合成。通过微生物发酵法及最适条件探索发现工程菌 Escherichia coli FD03 的最适生产条件为：温度 30℃，pH 7.0，诱导剂IPTG最适添加量 0.8 mM，底物葡萄糖加入浓度 40 g/L。工程菌 Escherichia coli FD04的最适生产条件为：温度 30℃，pH 7.0，诱导剂 IPTG 最适添加量 0.3 mM，底物葡萄糖加入浓度 55 g/L。对比基因工程菌株 Escherichia coli FD03 和基因工程菌株Escherichia coli FD04 的 L-茶氨酸生产情况，发现后者的 L-茶氨酸产率较前者提高了14.7%，L-茶氨酸逐步累积产量最大产量为 2.9 g/L。实现了葡萄糖一步发酵法生产 L-茶氨酸。同时也证实了茶氨酸转运蛋白过表达强化了 L-茶氨酸合成。在中型反应体系中 L-茶氨酸逐步累积产量最大为 2.9 g/L。实现了葡萄糖一步发酵法生产 L-茶氨酸。 （3）γ-谷氨酰甲胺合成酶 GMAS 的生物信息学分析。本研究利用生物信息学分析γ-谷氨酰甲胺合成酶 GMAS的相关生物信息，通过对 GMAS蛋白的基本理化性质及结构分析，结果表明大肠杆菌 GMAS 蛋白属于非分泌蛋白，是一种稳定的亲水性蛋白，且不属于跨膜蛋白。通过蛋白功能结构域分析，结果表明 GMAS 蛋白具有保守结构域。本研究为GMAS蛋白的异源表达生产提供了重要研究基础。
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