摘要
寡核苷酸疗法通过精准地调控目的基因的表达，让编码异常的基因保持沉默，来阻止目的基因的蛋白质表达。目前人工合成的寡核苷酸药物包括反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASO)、短发夹 RNA(shRNA)、小干扰 RNA(siRNA)、微小 RNA(miRNA)、核酸适配体(Aptamer)等，ASO、siRNA为临床中开发的寡核苷酸药物的主要形式。其中ASO是与靶基因或mRNA某一区段互补的核酸片段，可以通过碱基互补原则结合于靶基因/mRNA上，从而下调基因的表达。裸露的寡核苷酸受到核酸酶的影响，难以进入细胞发挥作用，因此寡核苷酸的递送一直是寡核苷酸疗法应用于临床需要解决的重要一环，设计出合理安全并且简易的递送载体是寡核苷酸药物发挥作用的关键。 Survivin是一种细胞凋亡抑制基因，通过加速细胞增殖，抑制细胞凋亡发挥作用，它在胎儿组织和大多数人类癌症类型中均有高表达，但很少存在于正常的成体细胞中。因此survivin可以作为肿瘤治疗的潜在靶标，根据survivin mRNA的二级结构和碱基序列设计合成ASO,将ASO递送到肿瘤细胞内以调控survivin蛋白表达，发挥抗肿瘤作用。 烯壳铁氮磁珠(Graphene-shelled Ferro-Nitride Magnetic Beads,GFeNMB)，是一种石墨烯包覆的氮化铁纳米磁珠。该磁珠表现出超顺磁性，能快速响应外加磁场变化磁性。这种磁珠的外壳石墨烯通过π-π堆积相互作用和氢键对单链核酸具有较强的吸附能力，并且能淬灭吸附在表面的荧光团。基于石墨烯的生物相容性和对单链核酸的吸附特性，GFeNMB具有成为单链寡核苷酸药物运载工具的优势，因此本论文研究GFeNMB作为单链寡核苷酸递送载体，运载靶向survivin的ASO及对肿瘤细胞的转染和抑制作用。主要工作内容包括: 1.GFeNMB-Survivin ASO 载药体的构建:利用RNA draw 软件对 survivin mRNA的二级结构和碱基序列进行分析，针对选定的单链环状区域设计合成ASO,两端硫代修饰防止核酸酶干扰，合成FAM荧光团标记和未标记的ASO;依据GFeNMB对单链核酸的吸附能力，检测FAM荧光团修饰的ASO被磁珠吸附前后的荧光强度变化，确定单位质量GFeNMB对survivin ASO吸附量为0.44μg/mg,GFeNMB能稳定吸附单链核酸，20 min达最大吸附量;对GFeNMB和GFeNMB-Survivin ASO进行表征，透射电镜下可以看到磁珠明显的壳核结构，氮化铁磁芯外面是多层石墨烯外壳，粒度分析仪检测到GFeNMB吸附ASO后，平均粒径较GFeNMB有所下降，推断磁珠吸附单链核酸后，单链核酸的电荷作用改善磁珠在溶液中的分散性。 2.GFeNMB-Survivin ASO磁转染:首先，以常用的转染试剂空脂质体作为对照组，GFeNMB为实验组，通过转染细胞后检测不同时间点细胞活力，检测GFeNMB细胞毒性，实验结果表示GFeNMB的细胞毒性作用明显低于空脂质体转染，未发现对细胞活力有不良影响，说明GFeNMB可以用于细胞实验，与先前研究报道结果一致，其安全性优于脂质体;然后GFeNMB吸附survivin ASO构建载药体，在磁极作用下将survivin ASO磁性转染至肿瘤细胞中，以FAM荧光团修饰ASO示踪，用共聚焦荧光显微镜观察GFeNMB吸附ASO转染效果，细胞内呈现绿色荧光并集中于细胞核区域，脂质体转染后荧光集中分布在细胞内的核周围区域，可见GFeNMB核转染能力优于脂质体转染。由于GFeNMB吸附ASO进行磁转染过程是无序列特异性的，推断GFeNMB可以将不同序列的单链核酸递送到细胞内，有望成为单链核酸药物递送的工具。 3.GFeNMB-Survivin ASO转染对靶基因表达和细胞增殖的抑制作用研究:载药体磁转染进入A549细胞后，Western blot实验检测survivin在肿瘤细胞中的蛋白表达水平，下降水平优于正常细胞组和脂质体转染组，表明GFeNMB运载survivin ASO在细胞中发挥作用，阻断目的基因的翻译过程，下调目的蛋白表达;流式细胞仪检测到磁转染后细胞发生凋亡，并且凋亡比例随转染后时长增加而增加，细胞内活性氧水平上升，说明GFeNMB-Survivin ASO转染诱导细胞凋亡，使细胞内代谢活动发生变化;CCK-8实验和细胞划痕实验检测转染后的细胞增殖能力，实验结果说明载药体会降低细胞活力，抑制细胞增殖，并且细胞迁移能力也受到抑制。 综上，本研究中GFeNMB运载靶向survivin的ASO磁性转染至人肺癌A549细胞系，GFeNMB-Survivin ASO的核转染能力优于脂质体。GFeNMB-Survivin ASO在肿瘤细胞中下调survivin蛋白表达，使细胞发生凋亡，并且细胞活力和迁移能力都受到抑制，上述结果表明GFeNMB有望成为单链寡核苷酸药物的运载工具。
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