摘要
低等动物和哺乳动物与再生相关的生长因子和信号通路既有共享性又存在独特性，提示从低等动物入手研究促进高等动物损伤组织完美再生策略的可行。我国特有的卵胎生秦岭滑蜥(Scincella tsinlingenesis)断尾再生和断肢愈合的差异化形态建成是解析同一物种不同器官伤口愈合的良好模型。秦岭滑蜥断尾后可以再生出结构和功能相似的再生尾，但肢体受损后却只能形成瘢痕。Hippo-Yap信号通路的发现及其在器官生长和再生中的基本作用确定了其在组织再生中的潜能。通过切割法建立秦岭滑蜥断尾再生模型，腹腔注射Hippo-Yap信号通路的激动剂或抑制剂干预断尾再生，探索其对秦岭滑蜥断尾形态建成及转录调控的影响。分别设置Verteporfin实验组、XMU-MP-1实验组和DMSO对照组，比较再生尾大体解剖特征，统计再生尾的长度；利用组织学方法观察创伤处的异同；通过免疫组织化学方法明确Hippo-Yap信号通路相关蛋白的时空分布特征；聚焦伤口愈合时期开展无参转录组分析，解析Hippo-Yap信号通路对断尾再生转录调控的可能机制；比较中期因子Midkine及其受体在断肢疤痕愈合与断尾再生对应阶段的表达变化，分析Midkine在组织修复中作用。为蜥蜴类爬行动物割处再生研究提供理论依据。结果如下： 1. 参照小鼠注射剂量，确定了DMSO(4ml/kg)、Verteporfin(12.5mg/kg)和XMU-MP-1(1mg/kg)的最适注射浓度。断尾前1 d开始注射，进而切割断尾，两天注射1次，共计7次。大体解剖观察发现：断尾后的1-3 dpw(days post wounding)创面炎症及伤口面积的变化与DMSO对照组类似。断尾后28 dpw，XMU-MP-1实验组断尾再生速率大于对照组，随后再生速率减慢。断尾后60 dpw，再生尾明显较对照组短。Verteporfin实验组于断尾后 10 dpw 再生速率明显受抑制，至 60 dpw ，再生尾仅 15 mm。Verteporfin较XMU-MP-1抑制断尾生长效应显著。 2. 基于组织形态学，秦岭滑蜥断尾后不同实验组均经历止血、炎症、增殖和创面重塑四个时期，但伤口上皮的厚度和芽基的大小不同；DMSO对照组的伤口上皮厚度较同时期实验组厚。XMU-MP-1和Verteporfin通过抑制伤口上皮细胞增殖的形成从而影响断尾生。Hippo-Yap信号相关蛋白的免疫细胞化学定位结果显示：XMU-MP-1通过促进YAP的磷酸化，关闭Hippo-Yap信号通路阻止细胞核的转录。Verteporfin实验组Phospho-Histone H3和Ki67免疫蛋白较强，表明Verteporfin通过抑制Hippo-Yap通路，促进秦岭滑蜥断尾创面处细胞增殖，进而影响伤口愈合和芽基分化。DMSO对照组中Catenin-β蛋白表达明显高于Verteporfin实验组，Hippo-Yap信号可能协同Wnt信号共同调控秦岭滑蜥断尾再生。 3. 比较分析断尾后7 dpw与0 dpw的转录调控差异。注释结果有89,871条，设置FDR＜0.01和FC≥2筛选差异表达基因，空白对照组和DMSO对照组差异基因最多，空白对照组和Verteporfin实验组相比差异基因最少。对差异基因聚类分析发现DMSO对照组富集血液凝固，内皮细胞生长基因，XMU-MP-1实验组富集细胞的转录和Wnt信号通路，Verteporfin实验组则富集了机体呼吸相关基因；各组之间的差异基因富集在Wnt、mTOR和TGF-β信号通路，彼此互作参与秦岭滑蜥断尾再生形态建成。选取Hippo-Yap信号通路核心基因mst1、sav1、tead1、TAZ、kibra；相关靶基因ctgf、birc5、pola1、vim、myf6、14-3-3σ、tnc；Wnt和TGF-β信号通路相关的基因frizzled、smad2基因；以及炎症因子mk基因及其受体ptprz基因进行qRT-PCR的验证，其结果与转录组结果相吻合。 4. 中期因子Midkine及其受体PTPRZ参与秦岭滑蜥同步断尾再生和断肢疤痕愈合过程。Midkine及其受体PTPRZ在断尾再生和断肢疤痕愈合中的免疫定位及表达强度均呈现先增后减的变化趋势，且断肢中表达较断尾丰富，炎症阶段尤为显著。 Verteporfin和XMU-MP-1通过干预Hippo-Yap信号通路，扰动秦岭滑蜥断尾组织转录调控，并可能与Wnt、mTOR和TGF-β信号通路互作影响秦岭滑蜥断尾创面细胞增殖、分化和迁移调控断尾伤口炎症及上皮覆盖；Midkine通过其受体参与秦岭滑蜥同步断尾再生和断肢疤痕愈合。
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