摘要
冰糖橙味浓香甜、口感优良且果肉中富含维生素、类胡萝卜素、纤维、黄酮等多种益于人体健康的营养成分，倍受市场和消费者欢迎。截至目前，冰糖橙产业成为了我国很多省市的重要农业经济支柱产业。然而冰糖橙绿霉病发病率高的问题严重制约了冰糖橙产业高质量发展。近几年来，选育对绿霉病具有高抗性的冰糖橙品种受到了越来越多研究人员的关注，但由于冰糖橙对绿霉病致病菌入侵的应答调控机制尚不明确，严重影响了选育对绿霉病具有高抗性的冰糖橙品种的进程。因此，研究冰糖橙抵御绿霉病入侵的响应机理已经成为了一个冰糖橙抗性育种中迫切需要解决的问题。本研究以采自玉溪新平的冰糖橙为实验材料，从感病冰糖橙表面分离纯化获取绿霉病病原菌，将其回接至健康冰糖橙上，后对冰糖橙果皮中的部分生理生化指标进行测定，并结合转录组测序分析了绿霉病致病菌入侵下冰糖橙果皮中差异表达基因以及参与的代谢通路情况，此外还对冰糖橙内的NBS-LRR和PAL两个至关重要的基因家族进行鉴定和生物信息学分析，结合转录组数据探究了绿霉病致病菌入侵下两个基因家族的表达响应。从生理反应和基因表达层面探究了冰糖橙果实对绿霉病致病菌入侵的响应机理。研究得出以下结果： （1）本研究从发病的冰糖橙病斑处分离纯化获得了两株具有典型的青霉生长特征的青霉菌菌株M1和M3。对菌株M1和M3的ITS序列扩增测序并构建进化树，最终确定 M3 菌株与 Penicillium digitatum 亲缘关系最近，M1 菌株与Penicillium crustosum亲缘关系最近。综合观察M1 和M3 的长势，M3 远远快于M1，因此本研究选用M3菌株用于后续的研究。 （2）通过对接种了指状青霉后的冰糖橙果皮中的 POD、SOD、CAT、PPO以及 PAL 活性测定，结果表明指状青霉的入侵不同程度导致冰糖橙果皮中防御酶酶活性差异变化。随着时间的不断推移，PAL和SOD活性总体表现为不断上升，POD和PPO活性表现为先上升后下降，CAT活性始终表现为逐渐下降。 （3）本研究从接种了指状青霉后的冰糖橙果皮转录组中总共检测出了3409个差异基因，其中1804个表现为上调，1605个表现为下调。GO功能注释结果表明2291条差异基因被富集到了三个GO功能分类中，其中富集到细胞成分分类中的基因主要与光合作用发生场所的细胞成分有关；富集到分子功能分类中的基因主要与植物抗病相关酶活的调控有关；富集到生物学过程分类中的基因主要与植物中抗病物质代谢过程相关。KEGG通路富集分析表明冰糖橙在响应指状青霉入侵时，大量的差异基因被富集到植物病原体互作通路（map04626）、苯丙烷类生物合成通路（map00940）、MAPK信号转导通路（map04016）等与植物抗病密切相关的 KEGG 代谢通路中。进一步对这些通路探究发现，在指状青霉入侵下，冰糖橙主要通过激活PAMP触发免疫来响应指状青霉的入侵，在免疫过程主要包括以下几个环节：第一、通过Ca2+诱导、BAK1磷酸化修饰诱导或植物激素乙烯诱导激活冰糖橙细胞内的信号转导；第二、通过 MAPK 联级信号转导激活防御相关基因表达；第三、加速苯丙烷类化合物、木质素等抗性化合物生产，最终达到抗病效果。此外也发现，部分基因的表达产物也可以诱导发生超敏反应，帮助冰糖橙抵御病原菌的入侵。 （4）通过对冰糖橙NBS-LRR基因家族进行鉴定和生物信息学分析，共鉴定获得了111个NBS-LRR基因。通过对其进行启动子顺势作用元件分析，GO功能注释以及KEGG通路注释分析初步判定冰糖橙NBS-LRR基因可能在冰糖橙抵御指状青霉入侵的过程中发挥着非常重要的作用。进一步结合转录组数据对其在指状青霉入侵下的表达模式进行分析时发现 NBS-LRR 基因主要是以负调控为主，其主要是参与诱导冰糖橙的效应器触发免疫，诱导植物发生超敏反应，帮助冰糖橙抵御绿霉病入侵。 （5）通过对冰糖橙PAL基因家族进行鉴定和生物信息学分析，共鉴定获得了4个PAL基因，并且初步判定冰糖橙PAL基因可能在冰糖橙抵御指状青霉入侵的过程中发挥着非常重要的作用。指状青霉入侵下 PAL 基因家族表达模式分析结果表明PAL基因全部表现为正调控，其主要参与木质素的合成，帮助冰糖橙抵御绿霉病入侵。
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