摘要
【目 的】 本课题旨在：1. 利用生物信息学方法筛选与膀胱癌进展和预后相关的关键基因；2. 明确SMYD2在膀胱癌中的生物学作用；3. 运用转录组高通量测序技术（RNA-sequencing,RNA-seq）和染色质易接近性测序技术（Assay for Targeting Accessible-Chromatin using high-throughput sequencing ， ATAC-seq ）探索敲低SMYD2后，膀胱癌细胞基因表达谱以及染色质易接近性的变化，以寻找其下游关键基因；4. 探究SMYD2在膀胱癌中的分子调控机制，为膀胱癌的早期诊断和分子靶向治疗提供新的思路。 【方 法】 1. 综合生物信息学方法分析识别与膀胱癌进展和预后相关的关键基因 （1）从高通量基因表达（Gene expression omnibus, GEO）数据库中下载膀胱癌基因芯片数据集（GSE133624）并在癌症基因组图谱（The cancer genome atlas, TCGA）数据库中获取膀胱癌转录组数据和相应临床资料，使用R包“limma”分析TCGA数据和GEO数据中膀胱癌患者的差异基因。 （2）利用加权基因共表达网络分析（ Weighted correlation network analysis ， WGCNA）对差异基因进行共表达分析，筛选得到两个数据集的关键模块基因，再取两个关键模块基因的交集作为与膀胱癌进展相关的关键模块基因。然后利用套索算法（Least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）和支持向量机递归特征消除法（ Support vector machine recursive feature elimination ， SVM-RFE）筛选特征基因，选取两种算法筛选得到基因的交集基因作为候选特征基因。 （3）为了探究候选特征基因的表达对膀胱癌患者预后的影响，通过基因表达谱交互分析（Gene expression profiling interactive analysis，GEPIA2）验证关键基因的转录表达情况，利用Kaplan-Meier单因素生存分析鉴定与膀胱癌预后相关的关键基因，最后，将正常样本和肿瘤样本间基因表达呈显著差异同时生存也呈显著差异的基因确定为特征基因。 2. SMYD2在膀胱癌中的生物学作用 （1）利用细胞转染技术构建干扰和过表达SMYD2膀胱癌稳定转染细胞株，并通过荧光显微镜观察转染效率，利用RT-qPCR和WB进行最佳干扰筛选和表达效率检测。 （2）通过CCK-8实验、Edu细胞增殖检测法、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验分别探究SMYD2在体外对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。（3）通过建立裸鼠皮下成瘤模型研究过表达或干扰SMYD2在体内对膀胱癌生长的影响。 3. 联合应用RNA-seq和ATAC-seq寻找SMYD2的靶基因 （1）构建低表达SMYD2的稳定转染J82膀胱癌细胞株，应用RNA-seq筛选SMYD2干扰前后显著变化的基因。 （2）应用ATAC-seq检测SMYD2敲低前后细胞染色质易接近性的变化。 （3）对SMYD2敲低前后的RNA-seq和ATAC-seq数据进行一系列生物信息学分析，寻找膀胱癌中受SMYD2调控的潜在下游关键基因。 （4）通过RT-qPCR和WB实验检测敲低和过表达SMYD2的膀胱癌细胞株中SMYD2下游基因的差异表达情况。 4. 探究SMYD2在膀胱癌中的分子调控机制 （1）构建P53过表达载体和SLC39A10干扰慢病毒载体，分别转染膀胱癌细胞株，并用RT-qPCR和WB检测转染效率。 （2）通过回复实验研究SMYD2下游基因SLC39A10和P53对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。同时，检测膀胱癌细胞中铁死亡相关指标的变化情况。 （3）体内生物学功能回复实验进一步验证SMYD2影响膀胱癌的作用机制。 【结 果】 1. 综合生物信息学分析鉴定膀胱癌进展和预后标志物 （1）共筛选出189个与膀胱癌进展相关的差异基因，进一步通过LASSO回归分析联合SVM-RFE分析，筛选出14个关键基因（C1QTNF7，ATP1A2，FXYD1， CFD，LGI4，ACTA2-AS1，PER1，THSD4，SMYD2，CILP，ESM1，ULBP2， NMB和GAPDHP1）。 （2）总生存期分析结果显示肿瘤样本中高表达的SMYD2、GAPDHP1和低表达的ATP1A2、CILP、THSD4对患者总生存期有影响。5个特征基因与临床病理因素的相关性分析表明，它们在膀胱癌的进展中发挥着重要作用。 （3）差异下调基因ATP1A2、CILP、THSD4与大多数免疫细胞呈显著正相关，而差异上调基因SMYD2只与两类免疫细胞呈显著负相关，GAPDHP1与大多数免疫细胞呈显著负相关。 （4）RT-qPCR结果显示在膀胱癌组织和膀胱癌细胞系中SMYD2、GAPDHP1显著上调，ATP1A2、CILP、THSD4显著下调，与TCGA和GEO数据库中的结果一致。 （5）WB和IHC结果均显示SMYD2在膀胱癌组织中显著上调。 2. SMYD2的体内外功能验证 （1）成功构建过表达载体并筛选出sh-SMYD2-1为最佳干扰载体。 （2）sh-SMYD2可以显著降低J82细胞株的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力，sh-SMYD2虽然可以降低J82细胞的划痕愈合能力，但却不显著。 （3）OE-SMYD2可以显著提高T24细胞株的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力，OE-SMYD2虽可以提高T24细胞的划痕愈合能力，但却不显著。 （4）体内实验结果表明过表达SMYD2可以促进膀胱癌肿瘤的生长，敲低SMYD2的表达可以抑制膀胱癌肿瘤的生长。 3. 联合应用RNA-seq和ATAC-seq寻找SMYD2的下游靶基因 （1）应用RNA-seq筛选出了敲低SMYD2后表达显著差异的基因有4420个，其中上调2405个，下调2015个。 （2）ATAC-seq显示GainDAR中Distal Peak有56个关联基因；GainDAR中Proximal Peak有207个关联基因；LossDAR中Distal Peak有27个关联基因；LossDAR中Proximal Peak有205个关联基因。 （3）RNA-seq和ATAC-seq数据联合分析发现染色质可及性增强且表达上调的基因有6个，分别是TRIM36、ADRB2、MAML1、CD274、ZNF438、KDSR；染色质可及性减弱且表达下调的基因有8个，分别是PRDX1、CTH、FLJ46875、SLC39A10、CALD1、LOC105375905、RAD54B、JRKL。 （4）RT-qPCR和WB结果显示SLC39A10在SMYD2敲低的膀胱癌细胞株中显著下调，在SMYD2过表达的细胞株中显著上调，与测序结果一致。 （5）基因功能富集分析找到了SLC39A10基因所富集的代谢通路，显示其在铁死亡通路中富集。 4. 体内外验证SMYD2通过SLC39A10/P53轴诱导铁死亡影响膀胱癌的进展 （1）RT-qPCR和WB检测结果提示P53过表达载体构建成功以及P53过表达T24细胞株转染成功； （2）SMYD2、SLC39A10和P53的细胞回复实验及细胞功能检测结果提示， SMYD2和SLC39A10的表达水平均与细胞增殖能力、克隆形成能力、划痕愈合能力和细胞侵袭能力呈正相关，P53的表达水平和细胞增殖能力、克隆形成能力、划痕愈合能力和细胞侵袭能力呈负相关； （3）SMYD2、SLC39A10和P53的细胞回复实验及铁死亡相关指标检测结果提示，SMYD2和SLC39A10的表达与ROS水平、MDA、LPO、总铁离子、Fe2+和GSSG含量呈负相关，与NADPH含量和GSH/GSSG水平呈正相关；P53的表达与ROS水平、MDA、LPO、总铁离子、Fe2+和GSSG含量呈负相关，与NADPH含量和GSH/GSSG水平呈正相关。 【结 论】 1. SMYD2、GAPDHP1、ATP1A2、CILP和THSD4是膀胱癌进展和预后相关的关键基因，可作为膀胱癌临床治疗和预后预测的潜在生物标志物。本研究通过一系列生物信息学分析鉴定了膀胱癌中具有预后价值的基因，为膀胱癌患者的治疗提供了新的依据。 2. SMYD2的表达与膀胱癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和划痕愈合能力呈正相关；SMYD2的表达和膀胱癌肿瘤的生长呈正相关。 3. 基于染色质易接近性的变化和转录水平的研究发现：敲低SMYD2基因对膀胱癌细胞株中染色质的开放情况有较大的影响，且影响SMYD2调控的下游基因SLC39A10的表达。 4. SMYD2通过调控SLC39A10和P53的表达抑制铁死亡进而促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
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