摘要
植物在受到病原菌侵染后，会激活复杂多样的防御机制。这些机制涉及到植物细胞的结构变化、相关抗性代谢途径的激活和基因表达水平的差异。开展植物应答病原菌的防御机制相关研究，对防治植物病害、提高植物品质和分子育种等方面有重要意义。山药（Dioscorea opposite）是薯蓣科薯蓣属多年生缠绕藤本植物，药食两用，具有重要的经济价值。但因山药长期进行营养繁殖，导致其品种退化、抗性降低，黑斑病、炭疽病等真菌病害现象明显，给农业生产带来了严重损失。目前有关山药响应真菌侵染的防御机制研究较少，本研究以豫产道地药材——铁棍山药（D. opposite cv. ‘Tiegun’）为研究对象，使用山药病原真菌（细交链孢霉）和山药内生真菌（青霉菌）侵染山药愈伤组织，研究了愈伤组织受到侵染后的细胞结构、生理生化特性、防御代谢通路和差异基因表达的变化。主要获得如下创新性结果： （1） 从铁棍山药黑斑病病害叶片中分离出细交链孢霉（Alternaria tenuis），从健康铁棍山药叶片中内生系统中分离出 3 株内生真菌，经测序鉴定分别是：青霉菌（Penicillium halotolerans）、枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。选取A. tenuis 和 P. halotolerans 与愈伤组织共培养 120 h。结果表明，A. tenuis 菌落完全覆盖愈伤组织，细胞结构皱缩严重，胞内含有大量菌丝，病情指数达到99.00；P. halotolerans 菌落覆盖了2/3 的愈伤组织表面，细胞结构轻微皱缩，组织内含有少量菌丝，病情指数为 46.00。结果表明 P. halotolerans 作为山药内生菌对愈伤组织的伤害较轻。 （2） A. tenuis 和 P. halotolerans 侵染过程中，愈伤组织的丙二醛（MDA）含量持续增加，其中A. tenuis 处理组的 MDA含量积累高于 P. halotolerans 处理组。该结果表明相同时间内A. tenuis 较 P. halotolerans 对愈伤组织造成更严重的膜脂过氧化反应。抗氧化酶系，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT），呈现先升高后降低的趋势。A. tenuis 处理组的 SOD、POD和 CAT 酶活性分别在 48 h、36 h 和36 h 时达到最大值，分别是对照组的 1.35、2.38 和 2.29 倍；P. halotolerans 处理组的 SOD 和 POD 活性在 72 h 和 36 h 时达到最大值，是对照组的 2.03 和 2.57 倍，但CAT 酶活性在整个侵染过程中一直处于上升状态。该结果表明 P. halotolerans 作为内生菌在相同的时间内能够快速调节植物抗氧化酶活性增加，清除活性氧带来的细胞伤害，减少MDA的积累。 （3） 利用同源克隆法从山药基因组中克隆出 2 条大小约 500 bp 的 RGAs，命名为RGA2 和 RGA4。对 RGAs 进行定量分析，结果表明：不同真菌侵染 120 h 内，2 个 RGAs表达量均呈现升-降的趋势。A. tenuis 处理组中 RGA2 的表达量于 72 h 时达到最大值，是对照组的 24.94 倍；RGA4 的表达量于 48 h 时达到最大值，是对照组的 30.22 倍。在 P. halotolerans处理组内，RGA2的表达量在72 h时达到最大值，是对照组的13.91倍；RGA4的表达量在36 h 时达到最大值，是对照组的 15.70 倍。由此推测 RGA2 和 RGA4 可能参与植物抗病防卫过程。 （4） 基于不同真菌侵染山药愈伤组织后的抗氧化酶活性和 RGA2、RGA4 的表达趋势，选择接种真菌 45 h 后的愈伤组织进行转录组测序分析，共组装得到 82,402 条unigene序列。将这些序列与六大数据库（NR，Swiss-prot，Pfam，eggNOG，GO和KEGG）进行比对，共有44,451条Unigene得到功能注释，占所有组装Unigene的54.38%，其中注释到的共同显著表达基因有7,740个，对这些基因进行KEGG富集，主要富集到苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成、植物-病原体相互作用等代谢通路，揭示了铁棍山药愈伤组织在多基因网络系统的调控下应答不同真菌的侵染。其中对富集到苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成代谢通路的部分差异基因的表达量进行分析，主要包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）和查尔酮合酶（CHS）等相关酶的基因，结果表明这些基因在两个处理组中共同上调，但 A. tenuis 处理组中上调倍数高于 P. halotolerans 处理组，该结果表明苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成代谢通路积极响应山药应对不同真菌侵染的免疫调控。但由于内生菌与植物之间存在共生的关系，因此其造成的免疫反应明显小于病原菌。同时该结果也为深入研究铁棍山药应对不同真菌侵染的共同防御机制奠定基础。
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