摘要
随着塑料制品的广泛使用，全球塑料的生产和消费持续攀升。然而，塑料废物的处置不当导致其在环境中的积累，并随着食物链传播对人类健康和海洋系统构成巨大的威胁。为了人类福祉和环境保护，亟需寻求高效、环保的解决方案来应对塑料污染难题。与传统焚烧和填埋等方法相比，微生物降解塑料废物被认为是更环保的替代方案。目前已有的塑料降解菌或酶主要分离塑料废物富集的生境，但其整体的降解效率偏低。大量的研究证实黄粉虫（ Tenebrio molitor）、大蜡虫（Galleria mellonella）及大麦虫（Zophobas atratus）宿主及其肠道微生物具有塑料降解能力。昆虫的食性选择需要经历漫长的进化，大多数昆虫喜食木质纤维素丰富的植物，如黄粉虫以麦麸为食。昆虫肠道微生物对天然聚合物的降解是一种长期自然选择的机制，但其并未经历对塑料的驯化过程。因此，昆虫降解塑料的能力是否源于木质素降解能力？同时，昆虫肠道微生物是否蕴含丰富的塑料降解酶？为了阐明以上两个科学问题，本研究以黄粉虫幼虫为研究对象，分别饲喂玉米秸秆（CS）和聚苯乙烯（PS），基于幼虫肠道微生物群落、宏转录组学及代谢组学分析揭示黄粉虫是如何从天然饲料中适应塑料。通过宏转录组差异表达基因以及代谢产物分析，解析幼虫对 CS 和 PS的共降解通路，并鉴定出共降解酶。此外，从黄粉虫肠道微生物木质纤维降解潜在酶中筛选出具有 PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）降解能力的水解酶 TmFae-PETase，结合分子动力学模拟（MD simulation）和定点突变探究该酶降解 PET塑料的催化机制。主要研究结果如下： （1） 黄粉虫幼虫肠道微生物对 PS 和 CS 具有相似的响应。黄粉虫幼虫在 30天内对 PS的摄取量（32.5%）显著低于 CS（52.0%），但这两种聚合物对其存活无不良影响。通过对肠道微生物进行抗生素清除实验发现宿主和肠道菌群协同参与 PS和 CS的降解，但 PS的降解更依赖于肠道微生物。FTIR、TGA和 GPC分析表明黄粉虫幼虫能降解 PS和 CS。采用 GC-MS鉴定幼虫的 PS和CS降解代谢产物，发现以长链脂肪酸为主的降解产物。此外，幼虫对PS和CS适应过程中形成了相似的肠道微生物群落结构，并发现菌株 Serratia sp.、Staphylococcus sp.和 Rhodococcus sp.均与 PS和 CS降解有关。 （2） 从黄粉虫幼虫肠道中筛选出具有 PS 和木质素共降解菌株。通过传统的可培养方法从 PS和 CS喂养的幼虫肠道中分别筛选了五株 PS和木质素降解细菌。其中，菌株 Lysinibacillus capsica PS-1、Brevibacter iumlinens PS-P2、Klebsiella aerogenes PS-P1和 Paenibacillus sp. PS-Z的 PS降解率分别是 8.5%、6.9%、6.2%和 5.4%。五株木质素降解菌株中，Raoultella sp. F-0 的木质素降解率最高，对碱性木质素和玉米秸秆的木质素成分降解率分别为 37.1%和13.8%，该菌株的漆酶活性约为 0.52 U/mL。然而，在 PS 降解菌中发现 K. aerogenes PS-P1、B. linens PS-P2 和 Paenibacillus sp. PS-Z 具有木质素降解功能。其中，K. aerogenes PS-P1菌株对 PS和木质素的降解效率较好。 （3） 黄粉虫幼虫对 PS 塑料的降解能力源于其木质纤维素降解机制。通过比较宏转录组学分析发现 PS和 CS处理组幼虫差异表达基因表现出类似的响应。其中 30个基因在 PS和 CS组共上调，并发现参与塑料和木质纤维素降解有关的潜在基因，如 LMCOs、CYP6/4、AGMO、ADHs、CES1、Lip 和ACSL，表明类似的酶参与 PS和 CS降解。KEGG代谢通路分析表明 PS和 CS处理组参与外源性物质降解相关的代谢通路（苯甲酸降解、苯乙烯降解、氯烷和氯烯烃降解、细胞色素P450对外源生物的代谢）及其丰度高于对照组。比较代谢组学分析进一步表明 PS和 CS组中出现了类似降解产物十四烷二酸和 2,4-二氯苯甲酸等长链脂肪酸，且差异代谢物聚类热图显示 PS和 CS组聚在一个分支，表明幼虫表现出类似的PS和CS代谢途径，PS和木质素可能是被同一类酶降解。即：首先通过氧化酶破坏 C-C 键后解聚，然后打开苯环进入长链脂肪酸的合成代谢，最后通过 Acetyl-CoA 酶的辅助下，进入 TCA 循环。此外，从宏转录组差异表达基因当中筛选出较高表达的基因 Lac640，其编码漆酶样多铜氧化酶（LMCOs）。酶学分析结合表观形态观察发现 Lac640 具有同时降解 PS 和CS的能力。 （4） 黄粉虫幼虫肠道微生物木质纤维素降解潜在酶中筛选出具有 PET塑料降解功能的酶。从幼虫肠道微生物宏基因组中统计木质纤维素降解有关的酶，基于基因丰度、相似性和是否具有完整的 ORF等条件进一步缩小候选基因的筛选范围。通过三丁酸甘油酯平板水解圈、降解产物的检测（ MHET 和TPA）、FTIR和SEM等方法初步鉴定具有高效PET降解酶。该PET水解酶蛋白结构与阿魏酸酯酶的同源性最近（相似性为 48%），因命名为 TmFae-PETase。该酶也具有阿魏酸酯酶活性，同时能水解 4-硝基苯酚丁酯酸（p-NP(C4)）、阿魏酸甲酯（MFA）、咖啡酸甲酯（MCA）、PET 塑料和木质纤维素。通过已知的PET水解酶比对发现 35℃下 TmFae-PETase的 PET降解活性高于 FsC，但不及IsPETase 和 LCC。在 50℃下，PET 水解能力高于 FsC 和 IsPETase，但低于LCC。此外，上述已知的 PET 降解酶也具有 MFA 和 MCA 水解活性。TmFae-PETase当温度为60℃、pH为8、盐浓度为0-1%时PET降解能力最佳。以PET作为底物进行的酶动力学结果显示 Km 和 Vmax 值分别为 9.09 mg/mL 和 20.06 μM/h。TmFae-PETase 对六种消费后的 PET 塑料（pc-PET）的降解实验结果表明其对结晶度 10%左右的 PET类型的食品包装盒的降解能力较高，达到高结晶度PET饮料瓶（30%）的200倍，其对结晶度高的PET的降解能力有限。 （5） 基于分子动力学模拟（MD）和定点突变分析探究 TmFae-PETase的催化机制。通过 AlphaFold2 预测 TmFae-PETase 的蛋白结构，并利用Autodock 进行酶与底物的分子对接。结果发现酶与底物 PET dimer 结合区域位于催化三联体（S96、D196 和 H226）周围。TmFae-PETase 与 PET dimer 的RMSD 表明酶与底物的结合比较稳定，其并未随温度的升高产生明显的变化，表明TmFae-PETase的热稳定性较好。为了探究TmFae-PETase降解 PET的关键残基和MD模拟的准确性，对于18个残基进行定点突变，发现突变体L95W、P122W和 P125A的PET降解能力比野生型TmFae-PETase有所提高。此外，通过测试 18 种突变体对 MFA、MCA 和 p-NP 的活性，结果显示催化三联体和Y26、M97突变后蛋白活性显著下降，表明以上氨基酸是维持 TmFae-PETase催化活性的关键位点。突变体L95W和P122W的MD分析表明Trp（W）氨基酸通过 π^π 相互作用促进酶与底物的结合，W 残基降低蛋白的自由结合能，从而有利于蛋白和底物PET的结合。 本研究以黄粉虫幼虫作为研究对象，阐明幼虫肠道微生物对塑料和木质纤维素的相似响应。由于类似的 C-C 键，塑料和木质素的降解途径参与的酶类似，并且木质纤维素降解有关基因中挖掘PET塑料降解酶。
NETL