摘要
日本沼虾（Macrobrachium nipponense）遍布东南亚各国的淡水水域，具有较高的经济价值，是我国最主要的淡水养殖甲壳类动物。近些年来，随着日本沼虾的自然资源锐减，集约化人工饲养也得到了大力发展。但是由于人工饲养规模不断扩大，日本沼虾出现了性早熟、个体过小、低商品性等种质衰退问题，限制了日本沼虾养殖业的健康发展。因此，研究日本沼虾性腺发育规律，对其性腺尤其是卵巢发育进行分子水平上的人工调控，是对其进行人工繁殖和育种，改良其种质的基础。核糖体不仅能合成蛋白质，还具有一些其它功能，国内外学者已经相继报道出核糖体蛋白在一些甲壳动物卵巢发育中的作用。本研究以日本沼虾为研究对象，克隆了核糖体蛋白S3a （MnRPS3a）/核糖体蛋白S24（MnRPS24）基因cDNA全长序列；利用实时荧光定量PCR（Quantitative real time polymerace chain reaction，qRT-PCR）技术分析了这两个基因在日本沼虾不同组织、不同发育阶段及不同卵巢发育时期的表达水平；制备了多克隆抗体，分析了这两个蛋白在日本沼虾卵巢中的定位；并通过重组蛋白孵育实验、5-羟色胺（ 5-hydroxytryptamine, 5-HT ）孵育实验以及 RNA干扰（ RNA interference ， RNAi）实验探究了这两个基因在日本沼虾卵巢发育中的作用。实验结果如下： 1.以日本沼虾卵巢总RNA为模板，通过cDNA末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）技术得到MnRPS3a/MnRPS24基因cDNA全长序列。MnRPS3a cDNA全长902 bp，开放阅读框801 bp，共编码266个氨基酸。多重序列比对和系统进化分析表明，日本沼虾 RPS3a 与同属于甲壳动物的墨吉对虾（ Fenneropenaeus merguiensis）RPS3a在进化树中聚为一支，系统发育关系最近。qRT-PCR结果显示， MnRPS3a基因在日本沼虾不同组织、不同发育阶段和不同卵巢发育时期中均有表达，其中在不同组织的肌肉中的表达量最高，在不同发育阶段的受精卵中的表达量最高，在不同卵巢发育时期的Ⅰ期卵巢中的表达量最高。MnRPS24 cDNA全长502 bp，开放阅读框417 bp，共编码138个氨基酸。多重比对及系统进化分析表明日本沼虾RPS24与同属于甲壳动物的普通卷甲虫（Armadillidium vulgare）RPS24在进化树中聚为一支，亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明，MnRPS24基因在不同组织的肝胰腺中的表达量最高，在不同发育阶段的雌性成虾中的表达量最高，在不同卵巢发育时期的Ⅲ期卵巢中的表达量最高。 2.对MnRPS3a/MnRPS24基因进行全长克隆，使用pET-32a作为载体构建pET32a-MnRPS3a/pET32a-MnRPS24重组质粒，原核表达获得MnRPS3a和MnRPS24重组蛋白，免疫小鼠（Mus musculus）后得到多克隆抗体。以制备的多克隆抗体为一抗，通过免疫荧光实验对这两个蛋白进行卵巢定位。结果表明，MnRPS3a蛋白主要定位于日本沼虾Ⅰ期、Ⅱ期卵巢中的卵原细胞和卵黄生成前期卵母细胞的细胞质中，Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅴ期卵巢中卵黄生成期卵母细胞、卵黄生成后期卵母细胞和成熟卵母细胞周围的滤泡细胞中，以及Ⅵ期卵巢中的滤泡细胞和少量的卵原细胞的细胞质中。MnRPS24蛋白主要定位于日本沼虾Ⅰ期、Ⅱ期卵巢中的卵原细胞和卵黄生成前期卵母细胞的细胞质中，Ⅲ期卵巢的基质中，Ⅳ期、Ⅴ期卵巢的卵黄生成后期卵母细胞和成熟卵母细胞周围的滤泡细胞中以及Ⅵ期卵巢中的少量的滤泡细胞中。 3.将日本沼虾卵巢外植体在纯化后的重组蛋白中进行孵育，检测MnRPS3a、MnRPS24及6个卵巢发育相关基因即卵黄蛋白原（Vitellogenin，Vg）、卵黄蛋白原受体（ Vitellogenin receptor ， Vgr ）、细胞周期蛋白B （ Cyclin B ）、细胞分裂周期蛋白 2 （ Cell division cycle 2 ， Cdc2 ）、Wee1、OTU结构域泛素醛结合蛋白（ OTU domain ubiquitin aldehyde binding 2，OTUB）基因的表达变化。结果表明，重组蛋白孵育后，这8个基因的表达水平与对照组相比均先极显著升高再极显著降低（P＜0.01），表明MnRPS3a蛋白和MnRPS24蛋白与日本沼虾卵巢的发育密切相关。 4.将日本沼虾卵巢外植体分别在含有不同浓度5-HT的培养基中进行孵育，检测MnRPS3a、MnRPS24及Vg、Vgr、Cyclin B、Cdc2、Wee1、OTUB基因的表达变化，结果表明一定浓度的5-HT在一定时间范围内能促进MnRPS3a和MnRPS24基因的表达，并由此通过影响卵巢发育相关基因的表达变化而对卵巢发育起作用。 5.利用RNAi技术使MnRPS3a和MnRPS24基因沉默后，检测了日本沼虾卵巢中Vg、Vgr、Cyclin B、Cdc2、Wee1、OTUB基因的表达变化，结果表明， MnRPS3a和MnRPS24基因沉默后，这6个卵巢发育相关基因的表达水平与对照组相比均极显著降低（P＜0.01），表明MnRPS3a及MnRPS24基因的沉默会抑制日本沼虾卵巢发育相关基因的表达，从而影响日本沼虾的卵巢发育。
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