摘要
急性肝衰竭（Acute liver failure, ALF）是一种具有高死亡率的临床综合征，常见致病因素包括病毒感染、肝脏缺血再灌注损伤、药物过量、特异性药物反应和有毒物质等。目前，肝移植是治疗ALF唯一的有效方法，但由于其成本高昂且肝源紧缺，因此，目前急需寻找新的有效药物治疗ALF。西南獐牙菜分布广泛于中国西南地区，被民间医学广泛用于治疗肝炎和其他肝病，但其对ALF的保护作用及机制尚未研究。本实验室的前期试验研究发现，西南獐牙菜乙醇提取物（Ethanol Extract of Swertia Cincta, ESC）具有良好的肝保护作用，因此本研究旨在探究ESC对脂多糖（ Lipopolysaccharides ， LPS ）联合 D-氨基半乳糖（ D-Galactosamine-2-n-sulfate, sodium salt，D-GalN）诱导的急性肝衰竭小鼠的保护作用，并阐明其作用机制，为ESC的应用提供一定的理论依据，主要研究内容及结果如下： 1 ESC活性成分的鉴定与筛选 通过液相色谱-质谱联用（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）检测ESC中的活性成分，之后根据类药五原则及其生物利用度评分对检测到的活性成分进行筛选，最后通过ProTox Ⅱ数据库预测ESC活性成分的毒理学性质。结果：①通过LC-MS检测ESC中的成分后，共初步鉴定出ESC中41种潜在成分，经过筛选，共保留了32种主要活性成分用于之后的网络药理学分析。②ESC中的主要活性成分为黄酮类、环烯醚萜类、氧杂蒽酮和萜类物质。③ESC中的主要活性成分基本无毒或低毒。结论：ESC中主要为黄酮类、环烯醚萜类、氧杂蒽酮和萜类物质，且对肝脏不会产生额外毒性。 2网络药理学 之后通过SwissTargetsPrediction和Genecard等数据库分别预测ESC与ALF的的靶点，并将两者取交集。接下来通过Cytoscape预测交集交集靶点的Dgree值，并Dgree值排名前十的靶点作为核心靶点，并通过GO数据库和KEGG数据库预测ESC治疗ALF的可能作用机制。最后将分子对接及分子动力学模拟对核心靶点进行初步验证，并通过GEO数据库对核心靶点进行进一步验证。结果：①共确定了383个药物靶点与547个疾病靶点，其中交集靶点共72个， Degree值排名前十的靶点为ALB, ERBB2, AKT1, MMP9, EGFR, PTPRC, MTOR, ESR1, VEGFA,和HIF1A。②根据ESC活性成分富集靶点的数目，确定了ESC中的关键成分，如圣草酚、木犀草素等。③KEGG富集结果中最显著的两条信号通路分别是 EGFR信号通路和PI3K/AKT信号通路。④在10个核心靶点中共有8个靶点在ALF患者中差异表达，其中PTPRC、MMP9、HIF1A在ALF患者中表达显著上调、VEGFA、ALB、AKT1、EGFR和ESR1在ALF患者中表达显著下调。⑤分子对接与分子动力学模拟结果显示，山奈酚、圣草酚、木犀草素与EGFR具有最佳的对接分数，且结合十分稳定。结论：ESC可能通过调控ALB, ERBB2, AKT1, MMP9, EGFR, PTPRC, MTOR, ESR1, VEGFA,和HIF1A等靶点及EGFR和PI3K-AKT信号通路发挥治疗ALF的作用，木犀草素、圣草酚及山奈酚可能是ESC中发挥药理作用的主要成分。 3 ESC对LPS/D-GalN诱导的ALF小鼠的保护作用 将小鼠随机分为7组，分别为空白对照组、模型组、阳性药物组、ESC对照组和ESC低中高剂量组，前7天分别给与相应的药物，给药第7天通过对除空白对照组和ESC对照组外的各组进行腹腔注射LPS/D-GalN进行ALF造模，造模6小时后，收样。之后通过测定小鼠血清生化，氧化应激和炎性因子，并对肝组织进行HE染色及TUNEL染色，探究ESC对ALF小鼠肝脏功能、肝组织结构、氧化应激、炎症水平和肝细胞凋亡程度的影响。结果：①ESC能够降低ALF小鼠血清中ALT、AST、TP和ALB水平，缓解肝功能损伤。②ESC能够提高ALF小鼠血清中CAT、SOD、GSH水平、并降低MDA的蓄积，从而减轻了肝脏氧化损伤。③ESC预处理后能够显著降低ALF小鼠的肝脏指数，同时改善肝脏组织病理变化。④ESC能够降低ALF小鼠血清中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平、从而减轻了ALF小鼠的炎症水平。⑤ESC能够减少ALF小鼠肝脏中凋亡细胞的数量、缓解了凋亡水平。结论：ESC主要通过发挥抗凋亡和抗氧化对ALF小鼠产生保护作用。 4 ESC对LPS/D-GalN诱导的HepG2细胞损伤的保护作用 根据体内实验结果，拟在细胞水平上进行进一步探究。通过CCK-8法分别检测了不同浓度的ESC和D-GalN处理后的细胞活性，确定了造模浓度和ESC的安全浓度。分组后，通过PI/AM荧光染色、ROS荧光染色、JC-10荧光染色、流式凋亡检测、生化指标与细胞因子检测来研究ESC对HepG2细胞细胞功能、凋亡水平、线粒体膜电位、炎症水平和氧化损伤的影响。结果：①当D-GalN浓度为30mM时,对HepG2细胞活性具有显著影响，且细胞活性小于50%，因此以LPS 1μg/ml联合D-GalN 30mM作为造模浓度。当ESC浓度小于50μg/ml时对HepG2细胞活性无显著影响，因此ESC的浓度应控制在50μg/ml以内，以25、12.5、6.25μg/ml为用药浓度。②ESC能够显著降低HepG2细胞培养液中的ALT和AST，同时降低了细胞内的IL-6、TNF-α和IL-1β水平，从而缓解了细胞的炎症水平。③ESC能够显著降低LPS/D-GalN诱导的HepG2细胞的细胞凋亡。④ESC能够显著降低HepG2细胞中活性氧的水平，同时逆转了LPS/D-GalN引起的HepG2细胞线粒体膜电位的降低，从而改善了 HepG2细胞的氧化损伤。结论：ESC主要通过改善凋亡和氧化损伤来缓解LPS/D-GalN诱导的HepG2细胞损伤。 5. ESC发挥保肝作用的机制研究 通过qPCR对网络药理学预测的ESC治疗ALF的核心靶点进行了验证。此外通过Western Blot对网络药理学预测的EGFR和PI3K/AKT通路的相关蛋白p-AKT、p-PI3K、p-mTOR、p-EGFR、p-ERK1/2表达量。由于ESC在发挥肝保护作用时与抗氧化损伤密切相关，于是我们进一步检测了ESC对Nrf2-HO-1信号通路相关蛋白HO-1、胞内 Nrf2和胞外 Nrf2的影响。结果：ESC上调了 p-AKT、p-PI3K、p-mTOR、HO-1、胞内Nrf2的表达量，下调了p-EGFR、p-ERK1/2和胞外Nrf2的表达量。结果：ESC能够通过激活EGFR和PI3K/AKT通路发挥抗凋亡作用，通过促进Nrf2的核转移，激活Nrf2信号通路发挥抗氧化损伤作用。 综上所述，ESC可有效缓解ALF小鼠的肝脏病变程度、肝脏氧化应激、炎症和肝细胞凋亡，并最终达到保护肝脏的作用。在体外实验中，ESC可以减轻LPS/D-GalN诱导的HepG2细胞氧化损伤、线粒体功能障碍和细胞凋亡，从而提高HepG2细胞的细胞活力，并最终达到保护细胞的作用。其机制可能是通过调控核心靶点（ EGFR、HIF1A、VGEFA、AKT1、ESR1、ERBB2和mTOR ）和相关信号通路（EGFR/ERK、PI3K/AKT和Nrf2/HO-1），实现抗氧化和抗凋亡的作用，从而起到肝保护作用。
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