摘要
目的： 本研究拟探究不同组织学亚型肺腺癌的复发模式、预后、分子学及肿瘤免疫微环境特征，希望通过全面了解不同组织学亚型肺腺癌的特征来进一步指导临床决策，从而改善肺腺癌患者的预后。 方法： 1、我们收集 2009 年 1 月到 2018 年 7 月间在本院接受根治性手术切除的 I-ⅢA期肺腺癌患者的所有资料。根据2015年WHO提出的病理学分类将肺腺癌患者分为3种亚型(LPA，APA/PPA，MPA/SPA)。主要研究终点是RFS和复发模式。 2、根据微乳头(MP)或实性成分(S)是否存在将纳入研究的肺腺癌患者分为 4 种病理学亚型，包括MP-/S-，MP+/S-，MP-/S+，MP+/S+。主要研究终点包括RFS、复发模式和器官特异性无复发生存。 3、搜集 209 例纳入患者的石蜡切片进行 Hamp;E 染色，评估三级淋巴结结构的分布密度。搜集650名纳入患者的石蜡切片进行免疫组化染色，评估肿瘤细胞（TC）和浸润性免疫细胞(IC)的PD-1/PD-L1表达情况。对比TCGA样本不同组织学亚型的免疫检查点相关基因（ICGs）的区别。 4、分析本中心不同组织学亚型的驱动基因突变情况。基于 MSK-IMPACT 以及BROAD队列分析不同组织学亚型的分子学特征；基于TCGA和EAS队列分析不同组织学亚型的差异基因及通路富集。 结果： 1、第一部分结果提示：三分类病理学亚型是独立的 RFS 预测因素（P=0.025），其中，APA/PPA 以及MPA/SPA 组的 RFS 明显差于 LPA 组（APA/PPA VS LPA， HR,1.97，95%CI：1.16-3.37，P=0.013；MPA/SPA VS LPA，HR，2.22，95%CI：1.25-3.94，P=0.007）。值得注意的是，分层多因素 COX 回归分析表明：组织学亚型仅在脉管癌栓阴性（P=0.020）或I期(P=0.050)人群中具有独立的RFS预测能力。在脉管癌栓阴性人群中，MPA/SPA组RFS明显低于LPA组（HR，10.87， 95%CI：1.36-86.73，P=0.024）。在I期人群中，对比LPA组，APA/PPA和MPA/SPA组患者的RFS 均明显缩短（APA/PPA VS LPA，HR，1.87，95%CI：1.04-3.35， P=0.038；MPA/SPA VS LPA，HR，2.51，95%CI：1.18-5.35，P=0.017）。在复发模式方面，LPA和APA/PPA组患者最容易发生肺转移(5.3%,11.4%)，而MPA/SPA组最容易发生脑转移(13.1%)。在器官特异性转移方面，对比另外两组，MPA/SPA组更容易发生脑（MPA/PPA VS APA/PPA VS LPA,13.1% VS 6.1 VS 0.5%）和淋巴结转移(9.5% VS 4.3% VS 0%)、胸外转移(19.5% VS 11.7% VS 2.3%)以及单一部位转移(29.3% VS 18.1 VS 6.6%)。 2、第二部分研究根据 MP 或 S 成分是否存在进行病理学分类。多因素 COX 回归分析显示，在脉管癌栓阴性和 I 期人群中，不同组织学亚型是独立的 RFS 预测因素(P=0.01，P＜0.01)。具体表现为：在脉管癌栓阴性患者中，MP-/S+组(HR， 2.58，95%CI：1.23-5.41，P=0.01)和MP+/S+组患者的RFS(HR，4.56，95%CI：1.47-14.22，P＜0.01)明显低于 MP-/S-组患者；在 I 期患者中，对比 MP-/S-组， MP+/S-组(HR，1.67，95%CI：1.13-2.48，P＜0.01)、MP-/S+组(HR，1.98，95%CI：1.21-3.23，P＜0.01)、MP+/S+组(HR，2.97，95%CI：1.43-6.14，P＜0.01)的 RFS均明显缩短。 总的来说，MP-/S-组、MP+/S-以及MP-/S+组患者最容易发生转移的器官均是肺（7.4% VS 16.6% VS 14.9%），其次是脑（3.5% VS 8.7% VS 13.4%）；然而， MP+/S+组最容易发生转移的器官是骨（10.3%）和淋巴结（10.3%)。值得一提的是，不同组织学亚型的复发模式存在区别，MP+/S-、MP-/S+组发生脑转移的概率明显高于 MP-/S-组（8.7%amp;13.4% VS 3.5%）； MP+/S+比 MP-/S-组更容易发生肝转移（8.2% VS 1.1%）；MP-/S+和 MP+/S+组的骨转移和淋巴结转移率均高于MP-/S-组（骨转移：8.1%amp;10.3% VS 3.5%；淋巴结转移：8.5%amp;10.3% VS 2.5%）；MP+/S-和 MP-/S+的肺转移发生率明显高于 MP-/S-组（16.6%amp;14.9% VS 7.4%）。进一步探究不同组织学亚型的无器官特异性转移生存。结果表明，组织学亚型是独立的无肺转移生存预测因素（P=0.01），MP+/S-组无肺转移生存率明显低于MP-/S-组(HR，2.66，95%CI：1.16-2.37，P＜0.01)；在无脑转移生存方面，组织学亚型也具有独立预后价值（P=0.051），MP-/S+组的无脑转移生存率明显劣于MP-/S-组(HR，1.87，95%CI：1.10-3.17，P=0.022)。 3、第三部分探究了不同组织学亚型的免疫微环境。分析组织学亚型与 TLS 密度的关系发现，三分类不同组织学亚型之间的瘤内 TLS 密度不同（P=0.043），其差异主要来源于MPA/SPA组瘤内TLS明显低于APA/SPA（P=0.013）。值得注意的是，不同组织学亚型之间的瘤周TLS密度存在显著差异，MPA/SPA瘤周TLS密度明显高于另外两组(P＜0.001，P＜0.001)。四分类组织学亚型的结果提示，不同组织学亚型的瘤周 TLS 密度存在统计学差异（P＜0.001）；对比 MP-/S-组， MP-/S+、MP+/S-以及MP+/S+组的肿瘤周围TLS均明显增高（P＜0.001，P=0.036， P=0.008）；此外，MP-/S+组瘤周TLS明显高于MP+/S-组（P=0.016），而与MP+/S+组无统计学差异(P=0.43)。 4、第四部分探究不同组织学亚型的分子学特征。MPA/SPA 的非同义 TMB明显高于另外两组（中位值，LPA VS APA/PPA VS MPA/SPA，3.9 VS 4.9 VS 7.9 Muts/Mb，P＜0.001）。不同组织学亚型的FGA也存在统计学区别（P＜0.001）；进一步两两对比发现，差异主要来源于 MPA/SPA 组与 LPA 组的区别（中位数， MPA/SPA VS LPA, 0.06 VS 0.02，P.adj=0.011）。同时，FGAfacets 随着肿瘤侵袭性的增高表现出升高的趋势（中位值，LPA VS APA/PPA VS MPA/SPA，0.17 VS 0.22 VS 0.30，P＜0.001）。对比另外两组，MPA/SPA的EGFR及其亚型（EGFR 19Del和21 L858R）突变率明显降低，而TP53 突变率明显升高。另外，分析 10 大致癌通路发现 4 条致癌通路在 MPA/SPA 组显著富集，包括 MYC（MPA/SPA VS APA/PPA VS LPA，14.3% VS 6.1% VS 9.1%，P=0.019）,NOTCH（8.5% VS 4.6% VS 1.1%，P=0.05）,P53（68.6% VS 42.8% VS 28.4%，P＜0.001）以及 Wnt（6.7% VS 5.1% VS 0%，P=0.03）；LPA 组 RTK/RAS 通路突变频率最高（LPA VS APA/PPA VS MPA/SPA，92.0% VS 90.8% VS 81.9%，P=0.028）。GO 和 KEGG 通路富集分析表明，MPA/SPA组过表达的基因主要富集于细胞周期、P53、自然杀伤细胞调节的细胞毒性作用、趋化因子、同源重组、DNA复制、TOLL_LIKE受体等信号通路。 结论： 病理学亚型是早期肺腺癌的独立 RFS 预测因素，特别是在无脉管癌栓或 I期肺腺癌患者中；微乳头成分或者实性成分的存在，无论是否是优势亚型，都与早期复发有关。不同病理学亚型可能具有独特的复发模式，微乳头成分可能与肺转移相关，实性成分存在可能与脑转移相关。MPA/SPA的免疫微环境高度抑制，具体表现为，富集于肿瘤周围的三级淋巴结构、显著高表达的免疫检查点共抑制相关分子及共抑制通路、明显低表达的免疫检查点共刺激分子。MPA/SPA 组的TMB、FGA、FGAfacets水平及TP53突变率显著增高，均提示MPA/SPA具有高度的染色体不稳定性；多条与细胞增殖和转移有关的通路明显富集于 MPA/SPA组。综上，MPA/SPA 是一组具有高度侵袭性和高度免疫抑制的浸润性肺腺癌亚型。
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