摘要
猪肠道真菌数量在微生物中的占比不足1%，相关研究极少。然而，真菌细胞体积约为细菌的100余倍，基因组大小约为细菌的3~10倍，很可能对肠道微生物功能的维持有重要作用。反刍动物和环境真菌的相关研究表明，部分真菌能编码高活性的碳水化合物活性酶，有较强的木质纤维素降解能力，推测猪肠道真菌可能也具有编码碳水化合物活性酶的能力进而参与饲粮碳水化合物的微生物代谢。因此，本研究首先采用高通量测序技术，研究了真菌在猪肠道内的组成和空间分布情况；其次考察了不同碳水化合物组合饲粮对猪肠道真菌群落结构的影响；最后运用体外培养技术和代谢组-转录组学联合分析，深入解析了猪肠道核心真菌对不同类型碳水化合物的响应规律和潜在机制，并鉴定了与此相关的真菌特异性碳水化合物活性酶，为深入认识猪肠道真菌的营养生理作用提供理论依据。 试验一 不同品种猪后肠真菌群落结构分析 本试验旨在研究三个不同品种猪的肠道真菌结构和组成，并通过分析真菌与细菌代谢产物短链脂肪酸（Short chain fatty acids, SCFAs）之间的相关性，为后续研究提供依据。试验从中国四川省的商业农场选取了三个不同品种且处于同一生理阶段的纯种健康母猪各 10 头，成华猪（日龄 200~210 d，平均体重为 90 kg），约克夏猪（日龄 140~150 d，平均体重为 60 kg）和藏猪（日龄 360~370d，平均体重为 50 kg），分别采集其直肠内容物，对其基因组ITS1区域进行高通量测序，并检测短链脂肪酸浓度。 结果表明：三个品种猪直肠内容物真菌区系中，担子菌门和子囊菌门是两个主要的门，Loreleia，Russula和Candida是所有样品中最主要的三个属。相似性分析发现组间差异显著（R = 0.113，P ＜ 0.05）。在 Top 10 优势门和属中，壶菌门，接合菌门，球囊菌门和Loreleia，Nephropma，Metschnikowia，Hydnocystis的丰度在不同品种间有显著差异（P ＜ 0.05）。典型相关分析表明，肠道真菌与乙酸和丁酸浓度的相关性高于丙酸。Spearman相关性分析进一步表明，Tomentella与乙酸和丁酸呈显著正相关， Loreleia 与丙酸呈显著正相关（P ＜ 0.05），而Nephroma 和 Taiwanofungus 与乙酸和丙酸呈显著负相关（P ＜ 0.05）。 以上结果表明，猪后肠真菌的结构和组成具有明显的品种特征，真菌可能参与了后肠碳水化合物代谢。 试验二 猪全消化道真菌的空间分布规律 本试验在试验一的基础上进一步探索猪肠道真菌的空间分布情况。试验选取遗传背景相似、日龄和体重相近的健康 DLY 育肥猪 11 头（先后采集两批，批次 1 猪 5头，批次 2 猪 6 头），平均体重为 128.41±1.25 kg，采集胃至结肠共 6 个肠段的食糜样本并针对其基因组ITS1区域进行高通量测序。 结果表明：在本试验条件下，猪的全肠道食糜中都检测到了真菌的存在。不同肠段间真菌的α-多样性（Richness和Shannon指数）无显著差异，而β-多样性在两个批次的个体间有显著差异（P ＜ 0.05）。此外，所有肠段中最主要的真菌门类是子囊菌门和担子菌门，其中子囊菌门的相对丰度随着肠段的下行而显著递减（P ＜ 0.05），而担子菌门和毛霉菌门的相对丰度随着肠段的下行呈显著递增（P ＜ 0.05）。在属水平上，优势真菌属为Kazachstania，Naganishia，Fusarium，Rhodotorula，Mucor等，其中 Naganishia 和 Mucor 的相对丰度随着肠段的下行呈显著递增（P ＜ 0.05）。此外，还发现全肠段的核心真菌属与优势真菌属呈高度重叠。 本研究发现，猪消化道不同部位真菌多样性的空间分布规律与细菌不同，且肠道真菌的组成和空间分布规律存在较大的个体差异。 试验三 猪肠道真菌对不同碳水化合物组合饲粮的响应研究 试验一的相关性分析表明猪肠道真菌与细菌的代谢产物SCFAs有关，推测肠道真菌可能参与饲粮碳水化合物（Dietary carbohydrate，DCHO）在后肠的微生物代谢。本试验旨在考察不同DCHO组合对猪结肠真菌群落结构的影响。试验选用162头健康 DLY 断奶仔猪，采用 L9 (34)正交设计，设置 3 种 DCHO 因素，每种因素设 3 个水平，即直链淀粉与支链淀粉（AM/AP）的比例（2∶1、1∶1和1∶2）、非淀粉多糖（NSP）的添加量（1%、2%和 3%），和甘露寡糖（MOS）添加量（400、800 和 1200 mg/kg）。每个处理 6 个重复，每重复3 头猪，试验期 28 d，试验结束后采集结肠食糜样本和饲料样本，对其基因组ITS1区域进行高通量测序和相关指标的检测。 结果表明：不同 DCHO 组合饲粮显著影响肠道真菌群落 α-多样性（P ＜ 0.05）和β-多样性（R = 0.264，P = 0.001），三种 DCHO 对结肠真菌的影响度排序为 MOS ＞ AM/AP 比值＞ NSP。Mantel 分析表明，NSP 和 MOS 水平与 Kazachstania 的相对丰度显著相关（P ＜ 0.05），AM/AP 显著影响 Saccharomycopsis，Aspergillus，Wallemia， Fusarium 和Mucor 的相对丰度（P ＜ 0.05），MOS 显著影响 Penicillium 和 Bifiguratus的丰度（P ＜ 0.05），NSP 与 Mucor 丰度显著相关（P ＜ 0.05），淀粉酶活性与 Fusarium和 Mucor 呈显著相关（P ＜ 0.05），β-葡萄糖苷酶活性与 Mucor 呈显著相关（P ＜ 0.05）。AM/AP 为2∶1，NSP 为 3％，MOS 为 1200 mg/kg 可能是对仔猪肠道真菌结构影响最大的DCHO组合，优势真菌为Kazachstania属。此外，还发现结肠食糜中真菌与主要的产 SCFAs 细菌之间存在显著相关（P ＜ 0.05）。 本研究结果说明饲粮DCHO组合能影响仔猪结肠的真菌结构，且与DCHO成分显著相关的大部分低丰度核心真菌也与结肠食糜中淀粉酶和 β-D-葡萄糖苷酶的活性显著相关，提示猪结肠真菌对DCHO的后肠消化有潜在意义。 试验四 猪肠道核心真菌菌株对碳水化合物的响应规律及其机制 基于试验三测序结果，本试验选择 2 种核心真菌[Candida albicans (Ca)和Saccharomycopsis capsularis (Sa)]，分别以试验三的 5 种 DCHO【菊粉（In），微晶纤维素（MCC），甘露寡糖（MOS）, 高直链玉米淀粉（AM）和高支链玉米淀粉（AP）】以及一种天然的不可溶纤维（小麦麸纤维，WF）为唯一碳源底物，体外培养 96 h 后对其进行代谢组和转录组学分析。 结果表明：Ca和Sa菌偏好利用可溶性碳源底物（In和MOS），对淀粉类底物利用效率最低。培养基中的总多糖和还原糖浓度在不同的发酵时间点有显著差异（P ＜ 0.05），2 种真菌对碳源的代谢规律和速率各异。不同碳源底物情况下，2 种真菌的差异代谢物 KEGG 通路主要富集于氨基酸、碳水化合物和嘌呤代谢途径，分别对应培养基中的氮源、碳源养分，及真菌的生长代谢。针对不同碳源底物，2 种真菌的CAZymes表达模式各异。以菊粉为碳源时，Ca菌的GH15表达量上调，可作用于菊粉α-1,2-糖苷键；以MOS为碳源时，Ca菌主要通过上调GH13_40、GH15、GH18、AA3、GH16_2、GH17 和 GH18 的表达作用于 β-1, 4-糖苷键、β-1, 3-糖苷键、α-1, 6-糖苷键、α-1, 2-糖苷键和 α-1, 3 糖苷键。与 Ca 相比，Sa 的基因转录水平整体较高，大量基因表达显著上调，推测Sa能通过上调多种GHs、GTs、Ces、CBMs以及PL4_2、AA5家族的基因表达，参与菊粉降解；而Sa对MOS的降解可能通过上调GHs、GTs和CBMs家族中的多种酶来实现。2种真菌在同一碳源底物下的碳水化合物活性酶表达谱完全各异。本研究同时发现了多种仅由真菌编码的特异性碳水化合物活性酶，如GH5_9、GH5_49、GH13_17 等。代谢组学和转录组学的联合分析表明，2 种真菌利用不同碳源底物的差异代谢物和基因能同时富集于多条碳水化合物代谢相关通路，多种碳水化合物活性酶与差异代谢产物呈显著相关（P ＜ 0.05）。 本试验结果说明猪肠道中的核心真菌可能更偏好利用可溶性碳源底物，与其编码的碳水化合物活性酶种类和调节方式有关。 综上所述，猪肠道主要的真菌门为担子菌门和子囊菌门，不同品种猪的后肠真菌结构存在显著差异；相似遗传背景的猪在不同个体间其消化道真菌的组成和空间分布规律也有较大的差异。不同碳水化合物组合饲粮会引发猪结肠真菌结构改变，真菌群落结构与饲粮组分、碳水化合物活性酶、产SCFAs细菌间均存在显著相关。猪结肠核心真菌编码特异性碳水化合物活性酶参与不同碳源底物的分解，对碳水化合物在后肠的微生物发酵有重要意义。
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