摘要
背景： 癌症是严重影响人类身体健康的世界性公共卫生疾病。其中，根据世界卫生组织癌症研究机构相关统计，乳腺癌已经成为全球发病率最高的恶性肿瘤。临床上对于乳腺癌的治疗主要集中在手术、放疗、化疗以及靶向治疗。然而，目前的治疗手段仍然无法达到理想的临床治疗需求，术后易复发、放/化疗抵抗以及药物副作用明显的问题仍然难以解决。因此，迫切需要开发出更加高效且安全的新型治疗策略。 通过在近红外二区(NIR-Ⅱ)操纵光响应纳米催化剂，将肿瘤微环境(TME)中的过氧化氢(H2O2)快速转化为活性氧(ROS)的光热-化学动力学(PTT-CDT)协同疗法是一种很有前途的抗癌策略，因为它具有精确的时空选择性和极低的副作用。然而，这一策略受到纳米催化剂有限的ROS生成速率的极大影响。相对于传统的铁基芬顿试剂，尽管铜基纳米催化剂在提高催化速率和拓宽pH应用范围方面表现更出色，但其治疗效率仍然受到肿瘤抗氧化防御的限制。血红素加氧酶-1(HO-1)和谷胱甘肽(GSH)作为癌细胞抗氧化防御系统的重要成员，在维持细胞内氧化还原平衡中发挥着关键作用。此外，光热诱导的热休克蛋白(HSPs)表达上调可有效抑制细胞色素C/dATP介导的caspase激活并促进受损蛋白重折叠，从而抵抗应激诱导的细胞损伤，导致治疗效果不佳。二硫化钼(MoS2)是一种具有类石墨烯结构的二维过渡金属二硫化物，由于其出色的光热性能、易于修饰的二维表面和良好的载药能力而在癌症诊疗领域受到广泛关注。基于此，设计一种能够打破肿瘤多重抗性的高效NIR-Ⅱ光响应纳米催化剂具有重要意义。 目的： 在此，通过一种创新合成策略制备了一种具有NIR-Ⅱ光响应和类过氧化物酶(POD-like)活性的二硫化钼-氧化亚铜(MoS2-Cu2O)纳米花(MC NFs)。随后，通过聚乙二醇修饰并进一步共负载槲皮素(QE,一种HSP70抑制剂)和锌原卟啉Ⅸ(Znpp Ⅸ，一种HO-1活性抑制剂)，构建了 MoS2-Cu2O-PEG@QE/Znpp Ⅸ(MCPQZ)纳米平台。本研究旨在探索MCPQZ作为一种新型NIR-Ⅱ光响应多功能纳米平台在乳腺癌的PTT-CDT协同治疗中的作用及其机制。 方法： （1）纳米材料的合成。首先，通过一步水热法合成得到MoS2纳米花;随后，以甘氨酸铜为铜前体，通过二次水热处理得到MCNFs;进一步，采用甲氧基聚乙二醇-巯基（mPEG-SH）对MCNFs进行表面修饰以得到MoS2-Cu2O-PEG（MCP）;最后，通过π-π相互作用在MoS2表面共负载QE和Znpp Ⅸ最终构建得到MCPQZ纳米平台。 （2）纳米材料的结构表征。通过透射电镜（TEM）观察纳米粒子形态和粒径大小;纳米粒度电位仪检测纳米粒子的粒径分布和Zeta电势;通过能量色散光谱（EDS）和X射线光电子能谱（XPS）分析纳米材料中元素分布、组成及价态;通过X射线粉末衍射（XRD）分析纳米材料的物相结构;电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）分析纳米材料中元素含量;傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振氢谱（1H NMR）分析纳米材料中的有机物结构;分别通过UV-Vis和荧光分光光度计检测QE的特征吸收峰和Znpp Ⅸ的特征荧光发射峰，确证二者在MCPQZ中的成功负载并计算负载效率。 （3）纳米材料的理化性能测定。通过紫外-可见（UV-Vis）分光光度计检测MC NFs的近红外吸收性能;通过记录MC NFs在1064 nm激光的照射下溶液体系的温度变化来检测其光热响应性能和光热稳定性;以对苯二甲酸（TA）为羟基自由基（·OH）的检测探针，通过荧光分光光度计检测430 nm处荧光强度以评价MC NFs的POD-like活性，并对其酶促反应动力学进行分析;通过动态光散射法（DLS）评价MCPQZ的体系稳定性;通过UV-Vis分光光度法检测MCPQZ中QE和Znpp Ⅸ的释放;此外，还检测了不同条件下MCPQZ的POD-like 活性。 （4）MCPQZ的体外抗肿瘤作用。采用4T1小鼠乳腺癌细胞作为研究对象。通过荧光显微镜观察MCPQZ的细胞摄取行为和亚细胞定位;分别通过C11-BODIPY581/591荧光探针和吖啶橙（AO）染色探究细胞内脂质过氧化（LPO）和溶酶体膜透化（LMP）程度;通过CCK-8和活/死染色验证MCPQZ对4T1细胞的杀伤作用;通过基于Annexin Ⅴ-FITC/PI法的流式细胞术检测细胞凋亡;分别通过2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和5,5''-二巯基（2-硝基苯甲酸）（DTNB）法检测细胞内ROS和GSH水平;通过蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞内HSP70和HO-1表达;通过胆红素测定法检测细胞内HO-1活性。 （5）MCPQZ的体内抗肿瘤作用。选用6-8周的雌性BALB/c小鼠，通过皮下注射4T1细胞建立异位移植瘤模型。首先，通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）评估MCPQZ在瘤内的时间分布和体内的生物分布。待肿瘤体积长至100 mm3,随机分组，尾静脉注射PBS或纳米药物12 h后给予NIR-Ⅱ光照射5 min,每两天测定瘤块体积大小，实时监测14天。不照光组作为对照。治疗完成后，处死小鼠，取出肿瘤组织，称重并进行统计分析。通过苏木精-伊红（H&E）染色和脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色法分别评估肿瘤组织病理损伤和凋亡情况;通过Western blot检测瘤内HSP70和HO-1表达;通过胆红素测定法检测瘤内HO-1活性。 （6）MCPQZ的体内生物安全性评价。治疗过程中，每两天测定一次小鼠体重。治疗完成后，取出4T1荷瘤小鼠瘤旁皮肤组织和体内重要脏器进行H&E染色，并采集血样进行血常规和肝肾功能指标检测，以评估MCPQZ的体内生物安全性。 结果： （1）结构表征结果表明，我们成功制备了粒径均匀、单分散性好、铜载量高的MC NFs。理化性能测定结果表明，MC NFs在1064 nm处的摩尔吸光系数为11.72 L cm-1 g-1,光热转化效率高达45.44％。在NIR-Ⅱ光照射下，MC NFs产生的体外ROS荧光强度和最大反应速率（Vmax）分别是不照光组的19.7倍和33.8倍，表现出光热增强的POD-like 活性。 （2）成功构建了多功能的MCPQZ纳米平台，其具有良好的体系稳定性，并表现出持续有效的药物释放行为。令人鼓舞的是，MCPQZ的POD-like活性没有受到PEG修饰和药物共负载的明显影响，而是在相同条件下表现出与MCNFs相似的催化活性。 （2）体外细胞实验结果表明，荧光显微镜观察到MCPQZ可被4T1细胞有效摄取并被溶酶体捕获;脂质过氧化检测和AO染色结果表明，MCPQZ在NIR-Ⅱ光照射下能够诱导最强烈的溶酶体LPO和LMP;细胞内ROS和GSH检测结果表明，MCPQZ在NIR-Ⅱ光照射下能显著升高4T1细胞内ROS水平并降低GSH水平;基于CCK-8、活/死染色以及细胞凋亡分析结果表明，与其他组相比，MCPQZ+NIR-Ⅱ组诱导了最强的4T1乳腺癌细胞杀伤作用，其细胞增殖抑制率高达80％，分别是MP+NIR-Ⅱ组和MCP+NIR-Ⅱ组的2.4和1.6倍;Western blott和胆红素测定结果表明，MCPQZ能有效下调细胞内HSP70表达和HO-1活性。 （3）体内实验结果表明，MCPQZ能有效蓄积于肿瘤组织，并在NIR-Ⅱ光照射下发挥了最强的肿瘤生长的抑制作用（肿瘤生长抑制率高达 85.7％）,显著高于 MCP+NIR-Ⅱ 组（61.2％）和 MP+NIR-Ⅱ组（41.0％）。H&E和TUNEL染色结果分别显示，MCPQZ+NIR-Ⅱ组导致了最严重的肿瘤组织病理损伤和细胞凋亡。 （4）体内生物安全性评价结果表明，治疗过程中对照组和所有给药组的小鼠体重均呈现平稳增加趋势;H&E染色结果表明，MCPQZ+NIR-Ⅱ组中瘤旁皮肤组织和体内主要脏器的病理损伤和对照组相比无明显差异;血液生化检测结果表明，MCPQZ+NIR-Ⅱ组的血常规和肝肾功能指标水平对照组也无明显差异。 结论： （1）成功制备了粒径均匀、单分散性好、铜载量高的MC NFs,其具有出色的NIR-Ⅱ光吸收能力、高效的光热转化能力和良好的光热稳定性。重要的是，得益于独特的复合结构，MC NFs在NIR-Ⅱ光照射下可通过MoS2介导的光热效应显著提高Cu+介导的类芬顿反应速率，表现出光热增强的POD-like活性。 （2）所构建的MCPQZ纳米平台表现出良好的体系稳定性、持续有效的药物释放行为，以及与MC NFs相似的POD-like活性。 （3）MCPQZ纳米平台能够被4T1细胞有效摄取并被溶酶体捕获，随后在NIR-Ⅱ光照射下通过多种途径协同发挥抗癌效应，包括MCNFs介导的光热增强的CDT，QE介导的HSP70表达下调，ZnppⅨ介导的HO-1活性下调，以及Cu2+介导的胞内GSH耗竭。基于此，MCPQZ可在NIR-Ⅱ光照射下原位触发强大的“ROS风暴”，通过·OH诱导的溶酶体LPO引起严重的LMP,从而激活溶酶体介导的癌细胞死亡。 （4）MCPQZ在体外和体内均能够显著地抑制4T1乳腺癌细胞的生长，通过打破肿瘤多重抗性和NIR-Ⅱ光触发的“ROS风暴”实现高效的PTT-CDT协同治疗，且无明显系统毒性。
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