摘要
猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.）是猕猴桃科猕猴桃属落叶藤本果树，果实富含营养物质，属于20世纪新崛起的水果，具有很好的市场前景。近些年来猕猴桃产业在全球范围蓬勃发展，然而对猕猴桃的基础研究相对滞后，大量优异资源及其有价值的基因还未被挖掘，其功能还有待阐明。稳定遗传转化是植物进行基因功能的有力手段，但对大多数木本植物建立高效的遗传转化体系比较困难。先建立原生质体和愈伤组织遗传转化系统成为一种代替，较稳定转化体系更省时省力。本研究以‘红阳’猕猴桃为材料建立了愈伤组织遗传转化体系，并优化了稳定转化体系；以‘海沃德’猕猴桃为材料建立了高效原生质体分离及瞬时转化体系，为猕猴桃基因功能鉴定、分子遗传育种提供技术基础。 获得的研究结果如下： 1. 建立了猕猴桃愈伤组织遗传转化体系。 （1）筛选出最佳外植体。以‘红阳’猕猴桃组培苗叶片、子叶、叶柄、茎尖、下胚轴、根、‘毛花’猕猴桃果实、‘红什2号’猕猴桃果实等为试材诱导愈伤组织。结果表明在MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+0.2 mg/L 玉米素+1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸培养基上，除‘红什2号’果实未诱导出愈伤组织外，其他外植体均可诱导出愈伤组织。从出愈时间来看，叶柄出愈时间最早，叶片次之，毛花猕猴桃果实出愈时间最慢；从出愈量来看，叶片诱导出的愈伤组织最多，是叶片本身大小的1-2倍，随之是子叶、茎尖、毛花猕猴桃果实等。因此，叶片为最佳外植体，其优点有取材容易，诱导时间较短且出愈量大等。 （2）愈伤组织诱导和增殖培养。以叶片为外植体，在不同激素组合培养基中诱导愈伤组织，结果得出：MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+0.5 mg/L 玉米素+0.5 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸为最佳愈伤诱导培养基；以上述诱导出的愈伤组织为材料，通过设计不同激素组合来筛选愈伤组织增殖培养基，结果表明：在N6+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.5 mg/L 萘乙酸培养上愈伤增值量最大且愈伤类型最适宜作为后续转化材料。 （3）转化条件筛选与验证。将上述的愈伤组织经过2-3次稳定的传代培养后，采用农杆菌介导法进行转化。通过筛选愈伤组织生长时间、预培养时间、共培养时间、抗生素浓度等条件，发现培养10-20 d的愈伤，菌液浓度（OD600）为0.8，侵染30 min，筛选3-5次条件下有部分抗性愈伤长出，经DNA水平检测，获得过表达AcMYB110愈伤。 2. 优化了‘红阳’猕猴桃稳定遗传转化体系，获得了AcGST1转基因株系。以叶片和叶柄为外植体进行农杆菌介导的转化，在OD600=0.6，侵染时间为10 min，共培养3 d，筛选培养4-5次的条件下，经DNA和RNA水平检测获得AcGST1转基因株系，且转基因猕猴桃叶边缘出现红色表型。利用qRT-PCR分析基因表达情况，发现与野生型猕猴桃相比，转基因猕猴桃AcGST1的表达量显著上调。 3. 建立了猕猴桃愈伤组织原生质体分离纯化体系。以‘海沃德’叶片愈伤组织为材料，通过筛选愈伤组织继代时间，不同酶组合及浓度、甘露醇浓度、细胞过滤筛孔径大小、酶解时间等条件获得最优原生质体制备条件。优化条件为：2%纤维素酶和0.5%离析酶的组合下（0.7 M甘露醇浓度），黑暗条件酶解7 h，产量为2.83×106 g/FW，活力达86.94%。通过PEG介导法将GFP-MYB61转入原生质体证明可用于猕猴桃瞬时遗传转化。
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