摘要
目的:本研究通过体内和体外实验探讨DJ-1通过Nrf2调节自噬在糖尿病角膜上皮损伤愈合中的作用及机制。 方法:（1）构建STZ诱导的1型糖尿病小鼠（DM）模型，以同龄的正常血糖小鼠（ND）为对照组。分别于造模成功后1、2和4月，应用Cochet-Bonnet角膜知觉仪检测各组小鼠角膜敏感度;酚红棉线检测泪液分泌量;角膜荧光染色检测角膜上皮损伤以及角膜上皮刮除后上皮愈合情况;造模成功后4月，HE染色检测角膜结构与上皮厚度;PAS染色检测结膜杯状细胞数量;Western blot检测各组小鼠角膜组织中DJ-1和自噬标志分子LC3A/B的蛋白表达水平。 （2）构建STZ诱导的糖尿病DJ-1-/-小鼠（DM-DJ-1-/-）模型，以同龄DM组作为对照，分别于造模成功后1、2和4月，应用Cochet-Bonnet 角膜知觉仪检测各组小鼠角膜敏感度;酚红棉线检测泪液分泌量;角膜荧光染色检测各组角膜上皮损伤;造模成功后4月，HE染色检测角膜结构与上皮厚度;PAS染色检测结膜杯状细胞数量;DM组部分小鼠结膜下注射DJ-1重组蛋白为治疗组（DM+DJ-1），用角膜荧光染色检测各组角膜上皮刮除后上皮愈合情况，Western blot检测各组小鼠角膜组织中自噬标志分子LC3A/B的蛋白表达水平。 （3）高糖（40 mM，HG）培养人角膜上皮细胞为高糖组，正常糖（17.5 mM,Ctrl）培养为对照组，另外根据干预方式分为高糖+DJ-1抑制剂组、高糖+DJ-1重组蛋白组和高糖+DJ-1重组蛋白+Nrf2抑制剂组。用划痕实验检测各组细胞迁移能力;免疫荧光Ki-67染色和CCK-8检测细胞增殖能力;Western blot检测细胞内DJ-1、Nrf2和LC3A/B蛋白表达水平;电镜检测细胞内自噬小体数目。 使用SSPS 26.0软件进行统计分析，p值小于0.05为显著性。 结果:（1）与ND小鼠相比，成模后1、2、4月DM小鼠角膜敏感度未出现明显差异，但角膜荧光素钠染色评分升高（p＜0.0001）。2和4月时DM组泪液分泌显著少于ND组（p＜0.01）。成模后4月后，DM组角膜上皮损伤愈合速度、角膜上皮厚度和结膜杯状细胞数量均较ND组降低（所有p＜0.05）,角膜DJ-1与LC3B/LC3A比值也较ND组降低（p＜0.05）。 （2）与DM组相比，成模后1月及以后DM-DJ-1-/-小鼠泪液分泌量均显著下降（p＜0.01），但成模2月后才出现DM-DJ-1-/-小鼠角膜敏感度下降（p＜0.05）和角膜荧光素钠染色评分升高（p＜0.05）。成模后4月DM-DJ-1-/-组角膜上皮损伤愈合速度、角膜上皮厚度和结膜杯状细胞数量均显著低于DM组，角膜LC3B/LC3A降低（p＜0.05）。与DM组相比，DM+DJ-1组角膜上皮损伤愈合速度加快（p＜0.01），角膜 LC3B/LC3A 升高（p＜0.01）。 （3）与Ctrl组相比，HG组细胞迁移能力（p＜0.0001）和增殖能力（p＜0.001）受到显著抑制，细胞内DJ-1和Nrf2蛋白表达和LC3B/LC3A降低（p＜0.05），自噬小体数目减少（p＜0.01）。与HG组相比，DJ-1抑制剂能够进一步抑制细胞迁移能力（p＜0.01）、降低Nrf2表达和LC3B/LC3A（p＜0.05）,自噬小体数目也减少（p＜0.05）。而DJ-1重组蛋白显著增加高糖环境下角膜上皮细胞迁移能力（p＜0.0001）和增殖能力(p＜0.01），并升高 LC3B/LC3A（p＜0.01）和自噬小体数目（p＜0.01）。Nrf2抑制剂则可部分减弱DJ-1重组蛋白的作用。 结论:DJ-1缺失可加重糖尿病引起的角膜上皮功能失调及泪液分泌下降。DJ-1可通过上调Nrf2表达促进自噬，从而促进糖尿病角膜上皮损伤愈合。
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