摘要
鸡产蛋量的多少主要取决于卵泡的发育水平。环状RNA（circRNA）作为一种新型的内源性非编码RNA，具有比线性RNA更加稳定的环状结构，可以通过分子海绵机制靶向调控下游基因表达参与机体内的多种生物学过程。已有研究显示，在动物卵巢中，circRNA广泛参与卵母细胞及其周围体细胞的增殖、凋亡和类固醇合成等生理过程，从而调控卵泡发育。本人所在课题组前期对产蛋鸡的正常卵泡和就巢鸡的闭锁卵泡测序发现circWRNIP1在正常卵泡中的表达量显著高于闭锁卵泡，推测其可能参与调控鸡卵泡生长发育。本研究以体外培养的鸡原代颗粒细胞为试验对象，利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western Blot）、流式细胞术、细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、双萤光素酶报告基因以及免疫共沉淀（Co-IP）等试验技术检测了circWRNIP1在鸡颗粒细胞发育过程中的作用机制。主要研究结果如下： 1. RT-qPCR 检测发现，产蛋鸡不同发育阶段的卵泡（SWF、LWF、SYF、LYF）中的novel_circ_0008863表达水平均显著高于就巢鸡（P＜0.05或P＜0.01）。分析鉴定显示，novel_circ_0008863是由鸡2号染色体上WRN解旋酶相互作用蛋白1（WRNIP1）基因的2号和3号外显子反向剪接而成的环状RNA，因此命名为circWRNIP1。 2. 在体外培养的鸡原代颗粒细胞中过表达 circWRNIP1 可以促进细胞增殖相关基因PCNA、CCND1和 CDK2 mRNA的表达（P＜0.05），干扰 circWRNIP1 表达后得到相反的结果；CCK-8以及流式细胞术检测结果显示，过表达circWRNIP1能够促使处于增殖状态的细胞数量显著增加。综上，circWRNIP1促进鸡颗粒细胞的增殖。 3. 在体外培养的鸡原代颗粒细胞中过表达 circWRNIP1 可以显著提高孕酮合成相关基因CYP11A1和STAR mRNA和蛋白质的表达水平（P＜0.05 或 P＜0.01），干扰circWRNIP1后效果相反；ELISA结果显示过表达circWRNIP1可提高颗粒细胞中孕酮分泌水平，以上结果表明circWRNIP1促进颗粒细胞孕酮合成。 4. 通过RNAhybrid网站预测显示，miR-10a-5p可能是circWRNIP1的靶标miRNA。双萤光素酶报告基因试验结果表明，miR-10a-5p能与circWRNIP1的3’UTR序列靶向结合。在体外培养的颗粒细胞中过表达或干扰circWRNIP1使miR-10a-5p的mRNA水平相应下降或升高（P＜0.01）。综上，circWRNIP1可与miR-10a-5p靶向结合。 5. 在体外培养的颗粒细胞中过表达 miR-10a-5p 后，PCNA、CCND1、CDK2 以及CYP11A1、STAR的mRNA水平均显著下降（P＜0.05或P＜0.01），而干扰处理miR-10a-5p 后呈现相反的结果；CCK-8 和流式细胞术检测显示细胞中过表达 miR-10a-5p能够抑制细胞增殖；ELISA检测发现，过表达miR-10a-5p导致颗粒细胞中的孕酮分泌量降低。以上结果表明，miR-10a-5p可抑制颗粒细胞的增殖和孕酮合成。 6. 生物信息学预测显示，微管相关蛋白 RP/EB 家族成员 1（MAPRE1）可能是miR-10a-5p的靶基因。双萤光素酶报告检测发现miR-10a-5p能与MAPRE1基因的3’ UTR序列结合。在体外培养的鸡颗粒细胞中过表达或干扰miR-10a-5p后发现MAPRE1的mRNA和蛋白表达水平相应降低或上升（P＜0.05或P＜0.01）。以上结果说明，miR-10a-5p可抑制MAPRE1的表达。 7. 对 MAPRE1 基因进行功能验证发现，当体外培养的鸡颗粒细胞中过表达MAPRE1后，PCNA、CCND1、CDK2和CYP11A1、STAR的mRNA水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），干扰MAPRE1表达后结果相反；此外，CCK-8、流式细胞术、Western Blot 以及 ELISA 检测结果显示 MAPRE1 促进颗粒细胞的增殖和细胞中的孕酮合成。共转染 pcD25-ciR、pcD25-circWRNIP1、mimics NC 和 miR-10a-5p mimics 发现，circWRNIP1与miR-10a-5p靶向结合后可缓解miR-10a-5p对MAPRE1表达的抑制作用，并能解除miR-10a-5p对颗粒细胞增殖以及孕酮合成功能的抑制作用。 8. 通过 Co-IP 以及 Western Blot 检测发现，MAPRE1 能与 CDK2 结合形成复合物，在细胞中过表达或干扰MAPRE1后CDK2的蛋白水平相应升高或下降（P＜0.05）。以上结果表明，MAPRE1与CDK2结合并能促进CDK2的表达，从而在颗粒细胞的增殖和孕酮合成中起作用。 综上所述，circWRNIP1通过分子海绵机制靶向结合miR-10a-5p调节下游靶基因MAPRE1的表达来调控鸡卵泡颗粒细胞的增殖和孕酮合成，从而影响卵泡发育。结果可为研究 circRNA 调控鸡卵泡发育的分子机理提供参考，为提高蛋鸡产蛋性能的分子育种提供理论依据。
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